203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 A 8. ábra egy gujerati család tagjaitól származó DNS-mintákról készített autoradiogrammokat mutat be, melyeket azért készítettek, hogy különbözó miniszatellit-firagmentumok és a magzati hemoglobin örökletes fennmaradása (HPFH) nevű betegség öröklődésének esetleges kapcsoltságát kimutassák. A 9. A és 9. B ábra pedig két genetikai diagramm, melyek a HPFH és különböző miniszatellitek öröklődését mutatják be, egy soktagú rokonságban. A 10. ábra egy olyan diagramm, amely egy klónozott mesterséges miniszatellit előállítását mutatja be. A 11. ábra két különböző - nem rokoni eredetű - placentából származó DNS-mintából, új szintetikus hibridizációs próbák segítségével készített autoradiogrammokat mutat be. A 12. ábra egy sokgyermekes család tagjaitól származó DNS-minták hibridizációjáról készített autoradiogrammokat mutat be. A 13. ábra ikrek DNS-ének különböző hibridizációs próbákkal készített különböző DNS-sáv mintázatait mutatja be. A 14. ábra egy olyan autoradiogrammot mutat be, mely ugyanazon DNS-mintán, egyes, illetve kettős szálú DNS-hibridizációs próbával előállított mintázat összehasonlításának céljából készült. A 15. és 15. A ábra törvényszéki mintákból készített DNS-ujjlenyomatok autoradiogrammjait mutatja be. A 16. ábra egy kutyacsaládból származó DNS-ujjlenyomatokról készített autoradiogrammot mutat be. A 17. ábra egy rövidszőrű házimacska-családról készített DNS-ujjlenyomatokat bemutató autoradiogramm. A 18. ábra különböző juhokról két különböző hibridizációs próbával készített DNS-ujjlenyomatok autoradiogrammját mutatja be. A 19. ábra egy olyan autoradiogramm, mely három különböző sertésről készített DNS-ujjlenyomatokat mutat be. A 20. ábra egy tehéncsaládról és egyéb lábas jószágokról készített DNS-ujjlenyomatokról készített autoradiogrammot mutat be, míg a 21. ábra a 20. ábrán bemutatotthoz hasonlóan készített autoradiogrammot mutat be, melyet az előzőtől különböző hibridizációs próbával állítottuk elő. Egy 10-20 kilobázis hosszúságú fragmentumokat tartalmazó humán genomi génkönyvtárat - melyet emberi DNS Sau3A-val történő részleges emésztése után, 2JL47.1 fágban [Gene 20, 249 (1980)] klónoztunk - a „pAV33.7" jelű hibridizációs próbával teszteltünk, melyet a mioglobingén 33 bázispáros ismétlődéséből állítottunk elő. Több mint 40 különböző mértékben hibridizáló plakkot azonosítottunk a 3* 10s db rekombináns plakkot tartalmazó könyvtárból. A hibridizáló plakkok közül véletlenszerűen kiválasztottunk nyolcat (A33.1- 15), belőlük DNS-t izoláltunk, majd Southern blott analízis [J. Molec. Bioi. 98, 503 (1975)] segítségével kimutattuk, hogy minden rekombináns fág esetében annak csak egy bizonyos (0.2-2 kilobázis méretű) régiója mutat hibridizációt az eredeti próbával. A kérdéses szekvenciák meghatározása alapján kiderült, hogy minden hibridizáló régió egy-egy miniszatellitet tartalmaz, melyek 16 bázispár (A33.15) és 64 bázispár (A3 3.4) közé eső méretű ismétlődő szekvenciák 3- 29-szeres tandemismétlődéseiből állnak. A legtöbb miniszatellit különböző számú belső ismétlődést is tartalmazott. A X33.6 jelű fágban talált 37 bázispáros ismétlődő egység például egy 12 bázispáros alapegység háromszoros pontatlan ismétlődéséből tevődött össze. Mivel az izolált nyolc miniszatellitet minden esetben különböző DNS-szekvenciák szegélyezték, megállapítható, hogy mindegyik A33 jelű rekombináns fág a humán genom különböző régiójából származó inszertumot tartalmaz. A nyolc klónozott miniszatellit-régió 0,5-2,2 kilobázis méretű HinfI restrikciós fragmentumokon volt található, s mindegyik kisebb méretű volt azoknál a 2-6 kilobázis nagyságú, polimorükus fragmentumoknál, melyeket a humán DNS Hinfl-es emésztése után a pAV33.7 jelű hibridizációs próbával detektálni lehetett. Annak érdekében, hogy eldöntsük, vajon a megklónozott miniszalellit-régiők szintén polimorfikusak-e, 32P jelzett, egyes szálú DNS-hibridizációs próbákat állítottuk elő mindegyik miniszatellit megfelelő M13 szubklónjából, majd a próbákat igen szigorú körülmények között hibridizáltattuk 14 - nem rokon - kaukázusi eredetű brit állampolgártól származó, Hinfj-gyel emésztett DNS-mintákkal. A kapott tipikus hibridizációs mintázat azt mutatta, hogy az alkalmazott hibridizációs körülmények között minden próba a humáa^genomnak csak egy-egy meghatározott régióját ismeri fel, és ezen régiók közül három meglehetősen polimorfikus. A fenti eljárás pontosabban részletezett leírása megtalálható a példák között. » A polinukleotidoknak a fentiekben megadott definícióiról tehát elmodhatjuk, hogy mindegyik definíció eleget tesz a következő általános képletnek: H.(J.C.K.)„.L (8) ahol C egy ún. „core”-szekvenciát jelent, a többi betű pedig a fentiekben megadottak szerint értendő. Az összes definíció szerint az egyik ismétlődő egység „core”-szekvenciája lehet azonos a következő egységben találhatóval, de különbözhet is attól. A „core”-szekvencia például tartalmazhat egy vagy két plusz nukleotidot, hiányozhat is belőle egy-két nukleotid, de szekvenciája különbözhet is (mondjuk) 1-4 nutífeotidban az összes ismétlődő egységre vonatkozó konszenzusszekvenciától. A „core’’-szekvencia definícióvá többféleképpen is megadható. Az egyik általános definícióhoz úgy juthatunk el, ha megvizsgáljuk azt az eljárást, amellyel egy „core”-szekvenciát kimutathatunk. Ez úgy történik, hogy a genomi DNS egy miniszatellit-régióját olyan szekvenciarészlettel hasonlítjuk össze, mint például GGAGGTGGGCAGGAXG (2) A miniszatellitnek azt az x nukleotidhosszúságű szakaszát tekintjük „core”-szekvenciának, amely a lehető legnagyobb homológiát mutatja a (2) képlettel jelölt szekvenciából kiválasztható összes lehetséges x nukleotidhosszú szekvenciarészletek közül az egyikkel. Ez 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
