203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 4. sáv: Hampshire x Dorset nőstény 5. sáv: Dorset hím Mindkét próbával mindegyik birkából egyedspecifikus DNS-ujjlenyomatokat nyertünk. A DNS-ujjlenyomatok halványabbak és kevésbé összetettek, mint a humán DNS-ujjlenyomatok, de még mindig használhatók azonosítási célokra. A 33.6 próba egy vagy két igen intenzív polimorf csíkot mutat minden 'birkában, egy sor halványabb mellett Ezek a csíkok valószínűleg egy közös miniszatellitről származnak, ami véletlenül nagymértékben homlológ a 33.6 próbával. 24. példa Sertések és lovak A 19. ábra 3 különböző sertésből (1-3. sáv) és 3 különböző lóból (4-6. sáv) származó DNS-ujjlenyomatokat mutat be. (A nem és a fajta nem meghatározott.) A 33.6 és 33.15 próbák mindegyike minden állatnál egyedspecifikus DNS-ujjlenyomatot eredményezett A DNS-ujjlenyomatok, különösképpen a 33.15 próbával kapottak, halványak voltak és a humán DNS- ujjlenyomatokhoz képest nagyon kevés sávot tartalmaztak. Mindezek ellenére a két próba kombinált használata használható lesz egyedi azonosításra. 25. példa Szarvasmarhák A 20. ábra a Hinfl enzimmel emésztett DNS-ből a 33.6 próbával nyert DNS-ujjlenyomatokat mutatja be. A DNS-mintákat egy tehéncsaládból és további szarvasmarhákból nyertük. A példák: (l.sáv: emberi) 2. sáv: Dam 3. sáv: Sire 4. sáv: az 1. és 2. borja 5. sáv: Angus bika 6. sáv: Fresian bika Ahogy a birkáknál, sertéseknél és lovaknál is megfigyelhettük, egy elég egyszeri!, de mindazonáltal egyedspecifikus DNS-ujjlenyomatot kaptunk mindegyik állatnál. A borjúban minden csík visszavezethető volt a Dam és/vagy a Shire szülőre, ami megerősítette ennek az állatnak a származását 5 A 21. ábra a 33.15 próbával nyert eredményeket mutatja be ugyanazon a marha-DNS-en. Az egyes sorok jelölése: 1. sáv: Dam 2. sáv: Sire 10 3. sáv: az 1. és 2. borja 4. sáv: Angus bika 5. sáv: Fresian bika (6. sáv: emberi) A Hinfl enzimmel emésztett marha-DNS-en a 33.15 15 próbával történt hibridizációja egy intenzív és megfejthetetlenül bonyolult mintázatot eredményezett. A BglII enzimes emésztésnél ez az intenzív jel főleg a nagy DNS-fragmentumokra korlátozódik, azt sugallva, hogy ez a jel egy klaszterszekvenciából vagy régióból szár- 20 mazik - legvalószínűbben egy szokásos méretűi szatellit-DNS-ből. A rövid expozíciós idővel autoradiografált Hinfl enzimes emésztés létraszerűi mintázatot mutat a gél alján, ahol a „fokok” közötti távolság 45-50 bázispár (ez az adat nincs feltüntetve). így az intenzív jel 25 legvalószínűbben egy 45-50 bázispáros ismétlődő egységet tartalmazó szatellittől származik. A marha- DNS- ujjlenyomatok intenzitása jelentősen csökkent PvuII, v Ddel vagy Alul enzimmel való emésztés során, ami arra utal, hogy a szatellit-DNS ismétlődő egysége tar- r 30 talmazza ezen restrikciós endonukleázok hasítóhelyeit, ¥* de nem tartalmaz Hinfl és BglI hasltóhelyet. Ezek tpontosan a marha 1.720 szatellit jellemezól (E. Poschl and R. E.'Streek „Prototype sequence of bovine 1.720 satellite DNA”. J. Mol. Biol. 143; 1980), ami egy 46 35 bázispáros ismétlődő egység 100 000-szeres tandemismétlődéséből áll. Az 1.720 szatellit ismétlődő egységének és a 33.6 és 33.15 próbák ismétlődő egységeinek összehasonlítását az alábbiakban láthatjuk: „core” GGAGGTGGGCAGGAXG Hhal Ddel * ******* * 1.720 CTGGCGAGTATCAGGCAGATGAGCGGGCAGGTGTCGCGCGGCTCAG * * ********* 33.15 AGAGGTGGGCAGGTGG • Alul 33.6 Amint az látható, az 1.720 szatellit ismétlődő egysé- 50 ge csaknem tökéletes másolatát tartalmazza a „core”szekvencia 3’ régiójának (a megfeleléseket *-gal jelöltük). Az 1.720 szatellit ezen területe kiváló egyezést mutat a 33.15 próba ismétlődő egységével, de kevésbé jót a 33.6 próbáéval. Ez a magyarázata annak, hogy az 55 1.720 szatellit-DNS-t a 33.15 próba detektálta, a 33.6 próba pedig nem (lásd 20. ábra). Az 1.720 miniszatellit ismétlődő egysége (hasonlóan a mioglobin A33 miniszatellithez) a „core” mindkét oldalán túl sok nukleotidot tartalmaz [az (1) képlet szerinti J és K összege 60 **** ** * AGGGCTGGAGG PvuII nagyobb mint 15] ahhoz, hogy a találmány szerinti multilókusz felismerhető próbaként működjék. Annak érdekében, hogy a 33.15 próbával hibridizáló marha miniszatelliteket detektáljunk, a marha-DNS-t Alul és Ddel enzimekkel emésztettük, így az 1.720 szatellitet 46 bázispáros monomerekké degradáltuk, s ezeket a gélből „kielektroforetizáltuk”. A 21. ábrán látható, hogy borjú-DNS-ből valóban tiszta DNS-ujjlenyomatok nyerhetők mindkét restrikciós enzim segítségével (3-as szám), azonban a kapott csíkok csaknem mindegyike az 1.720 szatellit-DNS olyan blokkjaiból 29
