203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 származik, melyekben az összes ismétlődő egységből hiányoznak az Alul és Ddel hasítóhelyek (talán az egyik vagy másik fent aláhúzott bázis mutációt szenvedett, ami elrontotta az egymást átfedő Alul és Ddel hasítóhelyeket). Ez megmagyarázná a következő tényeket a) Látszólagosan egyező borjú-DNS-ujjlenyomatot nyertünk Alul és Ddel enzimet használva. b) A legnagyobb fragmentumok következetesen intenzívebben hibridizáltak, mint a kisebbek (mivel ezek természetesen több 1.720 szatellit ismétlődő egységet tartalmaztak; a legnagyobb borjű-DNS-fragmentum 440 ilyen ismétlődő egységet tartalmazott). Emberekben a csíkintenzitás nem nő párhuzamosan a mérettel (lásd 21. ábra). c) Majdnem mindegyik borjú-DNS-ujjlenyomatfragmentumot eliminálja a Hhal enzim, amelyik egyszeresen hasítja az 1.720 szatellit ismétlődő egységeit. (Adatok nincsenek ábrán feltüntetve, lásd feljebb.) d) Az apaállatnak Alul enzimmel történt emésztés után alig van bibridizáló fragmentje. Ez arra utal, hogy az 1.720 szalellit-DNS azon területe, amely ezeket az ismétlődő blokkokat tartalmazza, ennél az államál deléciós. e) Az anyaállat (1. számú) és a borjú (2. számú) ujjlenyomata közel azonos. Az anyaállat valószínűleg heterozigóta arra a delécióra nézve, amit az apaállatnál láthattunk, és véletlenszerűen a nemhiányos kromoszómáját (és így az összes csíkot) adta át a borjúnak. így ezen csíkok mindegyike kapcsoltságot mutat, és nem független módon transzmittálódtak az utódba, mint az embereknél. Mindazonáltal mind az öt szarvasmarhánál különböző szatellit-DNS-ujjlenyomatmintázatot kaptunk, így ezek a nem szokásos ujjlenyomat típusok is használhatók lehetnek egyéni azonosításhoz, de nem szolgáltatnak multilőkusz eredetű információt. Bizonyos próbák sikeresen működtek olyan esetekben is, amikor az (1) képletben szereplő n értéke nem volt kötelezően 3. Ezekben a próbákban legalább egy pár (J.core.K) ismétlődő egységet „core"- régiót nem tartalmazó DNS-szekvencia választhat el legalább két további ismétlődő egységtől. Ily módon lehetséges megfelelően hosszú próbát úgy szerkeszteni, hogy a (J.core.K) szekvenciákat párba rendezzük és a párok közé „core”-régiót nem tartalmazó szekvenciákat iktatunk be. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás genomiális DNS-minták meghatározására, azzal jellemezve, hogy a DNS-minta restrikciós endonukleázzal végzett hasítása útján kapott fragmentumokat olyan, izolált vagy klónozott formájú polinukleotiddal, amely az (I) általános képlettel adható meg, ahol a leolvasás iránya 5’—»3’: H.(J.coieiC)n.L (1)- a képletben a „core” olyan, legalább 6 egymást követő nukleotidből álló szekvenciát jelent, amely a következő - a fentivel egyező leolvasási irányban megadott - szekvenciák egyike: GGAGGTGGGCAGGAXG (2) AGAGGTGGGCAGGTGG (3) GG AGG Y GGGC AGG AGG (4) T(C)„GGAGGAXGG(G)pC (5A) T(C)mGGAGGA(A)qGGGC (5B) ahol: X-A vagy G, Y-C vagy T, m-0,1 vagy 2, p-0 vagy 1, n-legalább 3, q-0 vagy 1; J és K együttesen 0-15 nukleotidhosszúságú szegélyezőszekvenciát jelent az ismétlődő egységen belül; H és L egymástól függetlenül 0 vagy legalább 1 további nukleotidot jelent, amelyek az ismétlődő egységet szegélyezik; azzal a kiegészítéssel, hogy „core”, J és K nem feltétlenül azonos hosszúságú és összetételű szekvenciarészletet jelöl minden egyes (J.core.K) ismétlődő egységben, azzal a feltétellel azonban, hogy a polinukleotidnak felismerhetően ismétlődő konszenzus-szekvenciája van, és „core” egy variáns core-szekvenciát is jelenthet, feltéve, hogy az n darab ismétlődő egységben ténylegesen jelen lévő összes „core”-szekvencia legkevesebb 70% homológiát mutat az n darab ismétlődő egységben található összes „valódi core”-szekvenciákkal, amelyek a (2), (3), (4), (5A) és (5B) képleteknek felelnek meg -, vagy az (1) általános képletű polinukleotidéval komplementer szekvenciájú polinukleotiddal hibridizálunk, mimellett olyan polinukleotidot alkalmazunk, amely a DNS-mintának egy vagy több, a mintát a (J.core.K) ismétlődő egységnek megfelelő szekvencián belül nem releváns mértékben hasító restrikciós enzimmel végzett hasítása során képződő fragmens egynél több miniszatellit- régiójával vagy hipervariálható lókuszával hibridizálódni képes, és a hibridizáló DNS-fragmentumokat detektáljuk. (Elsőbbsége: 1984.11.12.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) képletű polinukleotidot használunk, amelyben a (J.core.K) ismétlődő szekvenciák egyikében sincs 25-néI több nukleotid. (Elsőbbsége: 1984.11. 12.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) képletű polinukleotidot használunk, amelyben a „core” maximálisan 16 nukleotidból áll. (Elsőbbsége: 1984.11.12.) 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) képletű polinukleotidot használunk, amelyben a „core” a megadott szekvenciáknak minimálisan 7 egymást követő nukleotidból álló része. (Elsőbbsége: 1984.11.12.) 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) képletű polinukleotidot használunk, amelyben „core” a megadott szekvenciáknak minimálisan 12 egymást követő nukleotidból álló része. (Elsőbbsége: 1984.11.12.) 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) képletű polinukleotidot használunk, amelyben a „core” olyan 14—16 egymást követő nukleotidokból álló szekvencia, amely a (2), (3), (4) szekven-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 30
