203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 lönbőző laboratóriumokban. A használt kettős szálú DNS-minták a következnek voltak: 1., egy kettős szálú 600 bázispáros Pstl-AHaüI fragmentum, ami tártál' mázzá a A33.15-ből származó „core"-miniszatellitet, 2., egy kettős szálú 720 bázispáros HaeEI fragmentum, ami a X33.6-ból származó „core”-miniszatellitet tartalmazza. Ezeket a nick-transzlációval jelöltök meg, így 0,5-l,0*109 cpm 3íP/pg specifikus aktivitású DNS-t kaptunk. A prehibridizáció és a hibridizáció körülményei megegyeztek a korábban tárgyalt standard módszerekével, kivéve, hogy l»SSC-t és 10%-os dextránszulfátot használtunk hibridizációs pufferben a kettős szálú próbáknál. A filtereket 1 órán keresztül mostuk l*SSC-ben és 1-3 napon keresztül - erősítőfólia jelenlétében - -70 *C-on autoradiografáltuk őket A18. és 19. példák diszkussziója Abban a hét esetben, ahol a zigoticitás a DNS-vizsgálatoktól függetlenül meghatározó volt a DNS-ből kapott eredmények egyezőek voltak a non- és placentavizsgálaton alapulókkal. A másik öt párban a zigoticitás egyértelmű meghatározására lehetőség nyílt a miniszatellit-próbák segítségével. A hasonló módon tanulmányozott hármasikrek trizigótáknak bizonyultak. Az esetek 50%-ában az ikrek zigoticitását sem a különböző nemek alapján (dizigótaság), sem az egychorionos placenta alapján (monozigótaság) nem lehetett megállapítani, így genetikai vizsgálatot kellett elvégezni. Az ilyen tesztek információtartalma arányos a vizsgált genetikai lókusz polimorfizmusának a mértékével, illetve a vizsgált lókuszok számával. Többszörös vörösvértest antigén- és enzimvizsgálatokkal a zigoticitás meghatározásának pontossága elérheti a kívánatos 95-98%-os értéket, de csak akkor, ha a populációban az odatartozó allélgyakoriság ismert (Nylander, P. P. S. The phenomenon of twinning. In: Barron, S. L. Thomson, A. M. eds. Obstetrical Epidemiology. London. Academic Press, 1983: 143— 165). Hasonló módon, a restrikciós enzimhelyek polimorfizmusán alapuló vizsgálat több hibridizációs próba esetén is egypetéjűség helytelen diagnózisát jelentős százalékban mutatta (Derom, C., Bakker, E., Vlietineck, R., Derom, R., Van der Berghe, H., Thiery, M., Pearson, P. Zyhosity determination in newborn twins using DNA variants. J. Med. Genet., 1985, 22: 279-282). A találmány szerinti miniszatellit-próbák áthidalják ezt a problémát az általuk vizsgált hipervariábilis DNS-fragmentumok nagy száma és jelentős variabilitása folytán. A korábban leírtak szerint a hibridizáló miniszatellit-fragmentumok ritkán azonosak véletlenszerűen kiválasztott egyedek között. (Vesd össze: 13. ábra, nem rokon személyekkel). A fentiekben megmutattuk, hogy annak a valószínűsége, hogy két rokoni kapcsolatban nem álló személy egyező DNS-ujjlenyomatot adjon mind a 33.6, mind a 33.15 próbáknál - melyek különböző részeit detektálják a hipervariábilis fókuszoknak -, elképzelhetetlenül kicsi (pcclO'1*, lásd 4. példa). Rokonoknál, akiknél a fragmentumoknak körülbelül a fele egyező, az egypetéjűség helytelen diagnózisának a valószínűsége <10'*. Ennélfogva a 33.6 és 33.15 próbák kombinált használata nagyságrendekkel megbízhatóbb eredményt szolgáltat, mint a korábbról ismert tesztek bármelyike. Az általánosabban használt kettős szálú miniszatellit-próbák sok olyan gyengébb csíkot nem képesek detektálni, amit a egyes szálú próbák igen (lásd 14. ábra). Ennek ellenére elég információ nyerhető segítségükkel ahhoz, hogy az egypetéjűség téves megállapításának valószínűségét 10~4 alá szorítsuk. A zigoticitás meghatározás ezen módszerének további előnye az, hogy nagyon kevés minta szükséges az analízishez. Vénás vagy köldökzsinórvér fél milliliteré mindig elegendő DNS-t biztosít. A zigoticitás meghatározásnak ezen direkt módszere által - akár újszülöttekről, akár idősebb ikrekről, akár hármasikrekről van szó - a többes terhességek különböző típusainak megállapítására, illetve azok meghatározóinak és következményeinek pontosabb epidemiológiai vizsgálataira volna tehetőség. A következő példákban a molekulatömegre utaló adatok nem szerepelnek, de a hatásos mérettartomány az 1,5-20 kilobázisos tartományban volt most is, akárcsak az előző eredményeknél. A DNS-ujjlenyomatok felhasználása a törvényszéki orvostaniban A 33.6 és 33.15 próbákkal detektált DNS-ujjlenyomatok egyéni specifitása kiválóan alkalmas személyek . azonosítására a törvényszéki orovostanban. Az egyetlen kérdéses pont az, hogy vajon fennmarad-e a DNS, például beszáradt vérben, vagy ondőfoltban olyan megfelelő, nem degradált állapotban, hogy még DNS- ujjlenyomat-analízisre alkalmas legyen. A törvényszéki eseteknél történő felhasználás megvalósíthatóságának vizsgálatát dr. Peter Gill (Home Office Central Research Establishment, Aldermaston) által szolgáltatott DNS-mintákon végeztük el. 20. példa Ruházaton beszáradt vér- és ondófoltot különböző időtartamokig hagytunk szobahőmérsékleten állni, miután dr. Gill extrakciót végzett (lízis SDS-sel, IM DTT jelenlétében, amit fenolos extrakció, majd etanolos kicsapás követett). A DNS-t hasonló módon vontuk ki friss hajhagymákból és hüvelykenetből, amit szexuális érintkezés előtt és után vettek. A mintákat Hinf$£nzimmel emésztettük, 0,8%-os agarózgélben ekktratforetizáltuk, majd nitrocellulóz filterre vittük át ^filtert 32P-vel jelzett, egyszálú 33.15 próbával hibridizáltuk a fentiekben leírt standard technika szerint Az elektroforizált minták: 1. 40 pl ondófolt ruhán, 4 hetes 2. 40 pl friss ondó 3. 60 pl friss vér 4. 60 pl vérfolt ruhán, 4 hetes 5. 60 pl vérfolt ruhán, 2 éves 6. 15 db hajhagyma (1-6 db származott ugyanattól a személytől) 7. 60 pl vérfolt ruhán, férfitől származó, friss 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 27
