203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 8. Hüvelykenet a 11-es személytől véve, 1 órával a 7-es személlyel történt közösülés után. 9. Lásd 8. pont, de 7 árával a közösülés után. 10. Hüvelykenet 11-es személytől. 11. 60 pl vérfolt ruhán, nőtől származó, friss A vizsgált DNS-ujjlenyomatokat a 15. ábra mutatja. Elégséges mennyiségű DNS-t (kb. 0,5-3,0 pg) nyertünk minden mintából az analízis elvégzéséhez. Beszáradt vérfoltban 2 évig, beszáradt ondóban 1 hónapig nem szenvedett lényeges károsodást a DNS, és azonos DNS-ujjlenyomatot mutatott az azonos személytől nyert friss véréből, illetve ondójából nyert DNS-ujjlenyomatával. A kenetminták elsősorban a nők, és nem a férfiak vérmintáinak feleltek meg, ami arra utal, hogy a kenetből gyűjtött legtöbb DNS a kenetvétel során lekapart hüvelyhámsejtből származott, nem a spermiumból. Mindemellett 3 nem női eredetű sávot sikerült detektálni a közösülés utáni mintákban. Ezek megfeleltek a férfi véréből kapott fő sávoknak, így a spermiumból kellett származniuk. Ezek a sávok kimutathatók a közösülés után 7 órával vett mintában is. Diszkusszió A fenti előzetes vizsgálatok azt mutatják, hogy bizonyos törvényszéki esetekben a minták épek maradnak, ezért a DNS-ujjlenyomatvizsgálat azonosítási célra alkalmazható bizonyos bírósági esetekben is. Például ezzel a módszerrel lehetséges nemi erőszakot elkövető ember azonosítása az áldozat ruháján talált ondófolt alapján. A nemi erőszak áldozatainak hüvelykenete esetében kevésbé egyértelmű a meghatározás a vaginális DNS-szennyeződés miatt. Mindazonáltal, amennyiben a szennyező, női eredetű DNS-t a spermium 2- DDT-s, vagy merkaptoetanolos redukciója (erre a spermium-DNS izolálásához van szükség) előtt, SDS-lízissel eltávolítjuk, - tisztább spermium-DNS-ujjlenyomatokat kaphatunk. Vagyis a nemi erőszakot elkvővetők azonosítása lehetséges lesz az ondófolt és/vagy hüvelykenet-DNS-ujjlenyomat vizsgálatával. Dr. Gill-lel együttműködve azóta további vizsgálatokkal erősítettük meg, hogy tiszta spermium-DNS-ujjlenyomat nyerhető a közösülés után vett hüvelykenetből, a fent leírt, előzetes elkülönítő technika segítségével. A 15/A ábra két hüvelykenetből nyert DNS-ujjlenyomatot mutat be, amelyeket a közösülés után 6,5 órával vettek (3. sáv). Az 1. sáv a férfi partner vérmintáiból készült ujjlenyomatokat mutatja, a 2. sáv pedig a női partner véréből készített DNS-ujjlenyomatot. A kenet női sejtmagvait előnyösen SDS/proteniáz K keverékkel történő előzetes inkubációval oldottuk fel. A spermiumsejtmagok ellenállnak ennek a behatásnak, és emiatt centrifugálással elkülöníthetők a női eredetű komponenstől. A spermiumsejtmagok későbbi lízise egy SDS/proteináz K/DTT keverék hatására következett be. Nyilvánvaló, hogy ez az elválasztási eljárás teljesen sikeres volt. Az ondószennyezett hüvelykenetből nyert spermium-ujjlenyomatok teljességgel megegyeztek a férfi partner véréből nyert ujjlenyomatokkal. Gazdasági szempontból fontos állatok humán miniszatellit- próbákkal kapott DNS-ujjlenyomatai 21-25. példák Kutya, macska, birka, sertés, ló és szarvasmarha véréből preparáltunk DNS-mintákat. 8 pg-os mintákat emésztettünk egy megfelelő restrikciós endonukleázzal (ha nincs más kiírva, akkor Hinfl-ről van szó), és a restrikciósán emésztett DNS-t fenolos extrakció után etanolos kicsapással nyertük ki. Az emésztett DNS-t vízből újraoldottuk, 0,7%-os agarózgélben elektroforetizáltuk, denaturáltuk, Schleicher-Schuell nitrocellulóz filterre vittük át, majd hibridizáltuk, ahogy azt korábban leírtuk a 32P-jelzett 33.6 és 33.15 humán miniszatellit-próbáknál. 21. példa A 16. ábra a 33.6 próbával vizsgált kutyacsaládból származó DNS-ujjlenyomatokat mutatja be. Az elektroforetizált minták: 1. sáv: vadászkopó apa 2. sáv: agár anya 3., 4., 5. sáv: a fenti szülők „greagle” kölykei (nőstény, hím, hím sorrendben). A humán DNS-ből nyerthez hasonló bonyolultságú, részletes DNS-ujjlenyomatokat kaptunk mindegyik kutyánál. A DNS-ujjlenyomatok lényeges variabilitást mutattak, amint az az apából, illetve az anyából nyert minták összehasonlításából látható (1,2 sávok). Mindhárom leszármazottnak különböző a DNS-ujjlenyomata, minden esetben csak olyan sávokat tartalmaznak, melyek visszavezethetők az apára és/vagy az anyára. Ezért a DNS-ujjlenyomatok ugyanúgy alkalmasak apasági vizsgálatokra és családfa-analízisre, mint az embereknél. A DNS-minták az 1-3 esetekben kissé degradáltak voltak, ezáltal leginkább a nagyobb csíkoknak (a leglassabban vándorlóknak) csökkent az intenzitásuk. A degradáció ellenére a csíkoknak a szülőkből az utódokba való átadódása egyértelműen meghatározható volt. 22. példa Macskák A 17. ábra egy rövidszőrű házimacska-családból a 33.6 próbával (bal oldalon), illetve a 33.15 (jobb oldalon) próbával kapott DNS-ujjlenyomatokat mutatja be. 1. sáv: apa 2. sáv: anya 3. sáv: kölyök Mindkét próba - a 33.6 és a 33.15 próba is - informatív DNS-ujjlenyomatot adott. A kölyökmacska legtöbb sávja anyai vagy apai eredetű volt, így ezek a DNS-ujjlenyomatok macskáknál is használhatók akár családfavizsgálatra, akár egyéni azonosításra. 23. példa Birkák A 18. ábra különféle birkákból a 33.6 próbával (bal oldalon), illetve a 33.15 (jobb oldalon) próbával kapott DNS- ujjlenyomatokat mutatja be. A minták: 1. sáv: keresztezett nőstény 2. sáv: keresztezett nőstény 3. sáv: Dorset nőstény 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60* 28
