203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 Eredmények értékelése Az emberi családfa-analízis megmutatta, hogy a miniszatellit-próbákkal detektált DNS-ujjlenyomatok megbízhatóan használhatók erősen heterozigóta DNS- fragmentumok szegregációjának vizsgálatára, még akkor is, ha az egyik szülő nem áll rendelkezésre a vizsgálatokhoz. Egy személynél, két próbát felhasználva, 34 hipervariábilis lókusz egyidejű analízise is elvégezhető, ami a genetikai maikereknek egy olyan nagy csoportja, mely messze meghaladja a hagyományos módszerekkel egyidejűleg vizsgálható markerek számát, beleértve az RFLP vizsgálatokat is. A variábilis miniszatellit-fragmentek stabil öröklődése, valamint az egyes fragmentumok alacsony populációs gyakorisága ideálisan alkalmassá teszi őket kapcsoltság vizsgálatára, mint ahogy azt láthattuk a két családfánál feltárt kapcsoltságoknál. Ki szeretnénk hangsúlyozni azt, hogy bár lehetséges, hogy ezek hipervariábilis miniszatellitek rekombinációs centrumok (rekombinációra erősen hajlamos részek), a hosszú miniszatellitrészekben előforduló nem ekvivalens cserék becsült gyakorisága (kb. 0,001 gamétánként) nem elég nagy ahhoz, hogy szignifikánsan befolyásolja a miniszatelÜt-lókusz és a szomszédos, betegséget hordozó lókusz közti kapcsoltság kimutathatóságát. A 33.6 és a 33.15 próbákkal együttesen meghatározott lókuszok számát 60-ra becsülték. Mivel körülbelül a lókuszok felénél legalább az alléi párok egyike azonosítható egy adott DNS-ujjlenyomatban, ezért a különböző DNS-ujjlenyomatok általában azonos a 16- kuszspektrumot érintenek. A legtöbb (esetleg az öszszes) vizsgált lókusz genetikailag nem kapcsolt, ezért ezek a humán genom nagyrészén, szétszórtan kell hogy elhelyezkedjenek. A pontos helyzetük nem ismert, megismerésükhöz meg kell várni az egyes hipervariábilis lókuszok klónozását és környezetük meghatározását. Érdekességként említjük azt, hogy az eddig vizsgált családfák egyikénél sem találtak az X, illetve az Y kromoszómákon miniszatelliteket Becsléseik szerint megközelítőleg 43 különböző lókuszt vizsgáltunk meg a lehetséges szexuális kapcsoltságra vonatkozóan a neurofibromatózisos család családfőjénél és HPFH-betegséggel terhelt család II4 jelű tagjánál Mivel az X és az Y kromoszómák a férfiak DNS-ének kb. 5%-át teszik ki, annak a valószínűsége, hogy a véletlenszerűen elosztó lókuszok egyike se helyezkedjen el ezeken a kromoszómákon 0,9543-0,l, így a nemmel kapcsoltságot mutató miniszatellitek tapasztalt hiánya nem szignifikáns. Ezek a szétszórt hipervariábilis miniszatellitek jól alkalmazhatók olyan markerek keresésére, melyek valamilyen betegséget hordozó lőkuszhoz kacsoltak. Ezt be is mutattuk esetlegesen választott példáinkban, ahol a neurofibromatózis, illetve a HPFH kapcsoltságát vizsgáltuk. Ellentétben a hagyományos egylókuszos genetikai analízisekkel, a DNS-ujjlenyomatok kapcsoltsági adatait nem lehet bővíteni több, rokonságban nem álló családok vizsgálatával, mivel minden családban valószínűleg különböző miniszatellit-allél kapcsolt a betegséget hordozó lókuszhoz. Ezzel szemben a DNS-ujjlenyomatokon alapuló meghatározás csak kiterjedt családfa esetén megfelelő módszer a kapcsoltság vizsgálatára (különösen domináns rendellenességek esetén), legideálisabb pedig a sokgyermekes családok esetén. Végül is a 33.6 és a 33.15 próbák egyénenként 34 darab autoszomális hipervariábilis lókusz meghatározását tették lehetővé. 20% a valószínűsége annak, hogy legalább az egyik ilyen lókusz szoros kapcsoltságot mutasson egy adott betegséget hordozó fókusszal (10 cM-en belül), feltételezve azt, hogy a miniszatellitek véletlenszerűen oszolnak el a 3000 cM hosszúságú emberi géntérképen. Több generációs családfáknál, mint péládul a HPFH-betegséget hordozó családnál, ez a valószínűség kb. 10%-ra csökken, mivel a legtöbb lókusznak csak az egyik allélje kiértékelhető, és ahhoz, hogy kimutathassuk a kapcsoltságot, ennek az alléinak párkapcsoltságot kell mutatni a betegséglókusszal. Ahhoz, hogy ezt a valószínűséget 50% fölé emelhessük, több mint 104 hipervariábilis lókuszt kéne azonosítanunk egy sokgyermekes családban, és több mint 204-et egy több generációs családfa esetén. Ezek a számok meghaladják a két felhasznált miniszatellit-próbával meghatározott összes lókuszok számát Azonban a 33.6 és a 33.15 próbákkal alapvetően különböző hipervariábilis miniszatellit-csoportokat detektáltunk, ami azt sugallja, hogy a „core”-szekvencia variánsait tartalmazó humán miniszatellitek száma igen nagy lehet. A konvencionális humán családfa-analízisnél meghatározott egylókuszos genetikai maikereket használnak, amennyiben vizsgált marker és a betegséglókusz közötti kapcsoltságot sikerül kimutatni, abból következtetni lehet a betegségért felelős génnek a DNS-en belüli körülbelüli elhelyezkedése, ami tovább pontosítható további családfák analízisével. A fentiek ellentéte igaz a DNS-ujjlenyomatokra. Egy hipervariábilis DNS-fragment és egy betegség közti esetleges kapcsoltság további vizsgálata csak a fragment preparatív gélelektroforézissel történő izolációja és klónozása után lehetséges. Az izolált miniszatellitből kiindulva a lókuszspecifikus hibridizációs próbákat tervezhetünk, akár egy jellemző, az izolált miniszatellitet közvetlenül szegélyező DNS-szekvenciarészlet felhasználásával, akár a teljes miniszatellittel történő, szigorú körülmények között végrehajtott hibridizáció segítségével. Ezek a lókuszspecifikus próbák felhasználhatók mind a kapcsoltsági adatok további családokra való kiterjesztésére, mind a miniszatelliteknek a humán DNS-en belüli helyének meghatározására. Ennek a megközleítésnek a bizonyítása folyamatban van egy 8,2 kB nagyságú Sau3A enzimmel végzett hasítással kapott miniszatellit-fragment klónozásával, amely fragment nyilvánvaló kapcsoltságot mutatott a Gujerati családban a HPFH-lókusszal. Amint azt a korábbiakban leírtuk, a 33.5, 33.6 és a 33.15 próbák mindegyike olyan miniszatelliteket tartalmaz, amelyek a „core”-szekvencia különféle variánsait tartalmazzák, eltérő DNS-ujjlenyomatokat eredményeznek és a humán vagy egyéb gerincesek DNS-ének különböző hipervariábilis miniszatelit-csoportjait de5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 3 60, 22
