203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 tektálják (lásd A. J. Jeffreys, V. Wilson, S. L. Thein, D. J. Weatherall és B. A. J. Ponder szerzők harmadik bejelentésében leírtak), annak köszönhetőién, hogy a különböző próbákban az alkalmazott „core”-szekvenciák mind hosszúságukban, mind pontos szekvenciájukban eltérnek egymástól. A különböző, variáns „core”-szekveneiákat tartalmazó tandemismétlődő fragmentek segítségével történő hipervariábilis régiómeghatározás megvalósíthatóságának vizsgálatához számos miniszatellit-régiót állítottunk elő szintetikus úton. 10. példa Mesterséges miniszatellitek szintetizálása és klónozása A „policore”-próbák szintézisének vázlata a 10. ábrán látható, amely az E.coli baktériumból származó „crossover” iniciátor-szekvenciát (Chi, GCTGGTGG) tartalmazó tandemismétlődő fragmentum klónozás útján történő előállítását illusztrálja. A poli-Chi-próba előállítása során standard DNS-technikákat alkalmaztunk, az előállítás lépései a kővetkezőik voltak: 1. A 8 nukleotidhosszú Chi-szekvenciát tandemismétlődésként tartalmazó szintetikus oligonukleotidokat a H. W. D. Matthes et al. (1984) EMBO J. 4, 561- 568. műben leírtak alapján állítottuk elő. Szintén előállottunk egy olyan második oligonukleotidot, amely dimerként tartalmazta a Chi-szekvencia komplementerét. 2. A fenti két oligonukleotidet 37 *C-on egymáshoz hibridizáltuk MgCU-ra és Tris-HCl-ra nézve 10 mM-os közegben (pH-8,0), ily módon rövid kétszálű DNS-fragmentumot alakítottunk ki. A második oligonukleotid-szekvenciát úgy választottuk meg, hogy egy olyan 3-nukleotidnyi 5’ túlnyúló véget tartalmazó molekulát eredményezzen, amely fej-láb ligálást tesz lehetővé. 3. Az 5’ vég foszforilálását T4 polinukleotid-kináz és ATP segítségével végeztük. 4. Az összekapcsolt DNS-fragmentek fej-láb ligálását T4 DNS-ligázzal és ATP-vel végeztük, így kaptuk meg a Chi-ismétlődéseket tartalmazó polimert. 5. A ligáit polimereket 1,5%-os agarózgélben történt elektroforézissel választottuk el, és a 150 bázispárosnál nagyobb polimereket DE81 papírra futtatva izoláltuk (Dretzen, G., Belláid, M., Sassone-Corri, P. és Chambon, P., 1981. Anl. Biochem. 112, 295- 298). 6. A kapott hosszú polimereket E.coli DNS-polimeráz I Klenow fragmentjével történő feltöltéssel alakítottuk tompa végűvé, majd az M13mpl9 RF DNS Sma I hasítóhelyre ligáltuk (J. Messing és J. Vierra, 1982. Gene 19,269-276.). A ligáit DNS-t E.coü JM101-be transzformáltuk, és a különálló fehér plakkokból egyszálú fág DNS-t izoláltunk. 7. Minden izolált klón DNS inszertjét dideoxynukleotid módszerrel szekvenáltuk meg (M. D. Biggin, T. J. Gibson és H. F. Hong, 1983. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80, 3963-3965) az inszertált polinukleotid hosszának, irányultságának és szekvenciájának meghatározása céljából. Találtunk egy olyan rekombináns M13 fágot - M13.core A-nak neveztük el - amely 50-szeres ismétlődésben tartalmazta az 5’—>3’ irányultságú Chi-szekvenciát az érett egyszálú fág DNS-ben (azaz „poli-Chi” rész volt inszertálva és nem „poli-Chi-komplementer”). 8. A 32P-vel jelzett egyszálú hibridizációs próbát primer meghosszabbítással állítottuk elő, s ugyanazokat a módszereket használtuk, melyeket a 33.6 és 33.15 fágok előállításánál. 11-15. példák öt további új mesterséges miniszatellit előállítása A fenti technika alkalmazásával a „core”-szekvencia öt további változatát szintetizáltuk, majd ezeket M13 fágba klónoztuk. Az így kapott „policore” rekombinánsokat M13 .core A-F névvel jelöltük. A „core”-variánsokat úgy választottuk ki, hogy azok mind hosszúságukban, mind szekvenciájukban különbözzenek. Az 5. táblázat az M13.core A-F kiónok ismétlődő szekvenciáit, a „core”szekvenciát, valamint - a további alkalmazásoknál részletezett - 33.5,33.6 és 33.15 hibridizációs próbák szekvenciáit hasonlítja össze. A leginkább invariáns bázisokat aláhúztuk. Az összes inszert M13mpl9 vektoron belüli orientációja is meg van adva. (-> jelentése: az inszert „policore”; t— jelentése: az inszert „policore” komplementere.) A „core”- szekvenciáktól való eltéréseket kisbetűvel jelezzük. A megjegyzés rovatban röviden jellemezzük az összes megadott szekvenciát. * 16. példa Az Ml3.core A-F próbák hibridizációja HinfI enzimmel emésztett humán DNS-sel Kezdeti vizsgálatként két nem rokon egyén emésztett DNS-ét a 33.15, illetve az M13.core A-F próbákkal hibridizáltuk. Két nem rokon eredetű placentából (1,2) vett, 8 pg DNS-mintát HinfI enzimmel emésztettünk, a mintákat 0,7%-os agarózgélben elektroforetizáltuk, majd Southern blott analízisnek vetettük alá mindegyik hibridizációs próbánál. A próbákat a leírás fő részében megadottak szerint, “P-vel jeleztük. A kapott autoradiogrammokat all. ábra mutatja be. Mindegyik próba mindegyik személynél számos DNS-fragmentet detektált. Eredmények A „B, C és D” próbák mindegyike olyan DNS-fragment ujjlenyomatot detektált, amely lényegein különbözött a két eltérő személynél. A különböző hibridizációs próbák azonos személy esetén is eltérő ujjlenyomatot szolgáltattak, bár sok fragmentumot nemcsak egy próba mutatott ki, és bizonyos fokú átfedés volt a 33.15 próbával meghatározott hipervariábilis fragmentcsoporttal is. Úgy találtuk, hogy a B-D próbák alkalmasak megfelelő DNS-ujjlenyomatok előállítására, és növelik az emberekben és más gerincesekben vizsgálható hipervariábilis miniszatellitek számát Figyelemre méltó, hogy a „core”-szekvenciábóFcsak a 7 legállandóbb központi bázist tartalmazó C próbával is sikerült nyert ujjlenyomatot nyernünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 23
