203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 tűk elő a 33.6 (A) vagy a 33.15 (B) próbát használva. Az elektroforézist egy viszonylag rövid (20 cm) agarózgélben végeztük. Az egyének közötti rokonság a 9. ábrán van megadva. A 9. A ábrán az a, b és c hipervariábilis fragmentumok szorosan kapcsoltak: vagy mindegyik megtalálható, vagy mindegyik hiányzik a család tagjainál. A 9. B ábra a „g” sáv és a HPFH koszegregációját illusztrálja. A IV 7 és IV 8 egyének egypetéjű ikrek, és a DNS-ujjlenyomatuk megkülönböztethetetlen. A felhasznált anyagok és módszerek a 8. példában leírtakkal egyezők. A koszegregáció analízisét a 9. A és 9. B ábra szemlélteti. A 9. A ábrán a II 4 egyén 30 hipervariábilis fragmentjének és a II5 egyén 27 hipervariábilis fragmentjének a ül 1-11 utódokba történt szegregációját vizsgáltuk meg, az esetleges szüléi AB fragmentek kapcsoltságára nézve. A kapcsoltság lehetséges példáit, melyek legalább 6/7-es öröklődési gyakoriságot mutattak (AB és —), további rokonoknál is megvizsgáltuk. A következőkben a kapcsoltság két legvilágosabb példáját mutatjuk be (a-f: a-f fragmentek megléte egy egyénben; • : fragmenthiány). Az a-c és e-f fragmentek tökéletes koszegregációt mutatnak. A d fragment tendenciajellegű koszegregációt mutat az a-c fragmentekkel, de a IV 1-4 generáció mintázata ebből a szempontból nem informatív és IV 7-8 egypetéjű ikrek a vizsgált fragmentumokra nézve rekombinánsak, mert ők csak az a-c fragmenteket örökölték, a d-t nem. A B ábrarészen a ß-thalassaemia öröklöttségének a jelei: © , D , a HPFH jele a H, a „g” pedig egy miniszatellit- fragment. Az egyéneket a HPFH-betegség szempontjából aszerint különítettük el, hogy HbF>l% (normális), vagy HbF>3% (ß-thalassaemiära jellemző). A HPFH és a ß-thalassaemia jellemzői függetlenül szegregálódtak a ül 1-11 és a IV 5-8 utódokba, és nemkapcsolt fókuszokként azonosítottuk őket. A g fragment tökéletesen koszegregált a HPFH-val a vizsgált személyeknél. Eredmények Amint a 9. A ábra mutatja, a HbF szint emelkedése a ß-thalassaemia tulajdonságtól függetlenül adódik át, és nyilvánvalóan egy autoszomális domináns fókusz által determinált, ami nem kapcsolódik a ß-globin-g6nklaszterhez. Egy hasonló szardíniái családfát ismertet a Gianni et al, EMBO J. 2. 921-925 (1983) cikk. A 8. A és 8. B ábrán 30 variábilis fragmentet értékeltünk a nagypapában (II4), és 27 fragmentet a nagymamában (II 5). Az ő hét leszármazottjuk (ül 1-11) vizsgálatából következett, hogy ezek a fragmentek legalább 22 különböző, nem kapcsolódó apai, illetve 18 ilyen anyai autoszomális fókuszból származtak - az alkalmazott kritériumok a neurofibromatózisos családnál leírtakkal egyezők. A maradék DNS-fragmentumok nyilvánvaló allelizmust vagy kapcsoltságot mutattak más fragmentekkel, noha a bizonyítás ilyen a kis rokonságon belül nem lehetséges. (Annak, hogy egy szülői DNS-fragmentpár allelikus, vagy kapcsolt párként adódik át 1:64 az esélye egy héttagú családban.) A családfa további tagjainál kerestünk további bizonyítékokat a kapcsoltságra, és a két legnyilvánvalóbb kapcsoltságot a 8., illetve 9. példában ismertettük. Az a, b és c fragmentumokat a 33.6 próbával detektáltuk, melyek a II 4 egyéntől kivétel nélküli kapcsoltságot mutatva adódtak át gyermekeinek (ül 1-11), illetve unokáinak (TV 1-8), a 14 kiértékelhető leszármazott közül egyik sem volt rekombináns (f^4»10'9 három koszegreáló sávra). A fentiek azt sugallják, hogy az a-c fragmentek egy azonos hipervariábilis fókuszból származó „haploid típusú” miniszatellitet reprezentálnak. A 33.15 próbával detektált d sáv szintén nyilvánvaló kapcsoltságot mutat az a-c fragmentekkel, habár a IV 1-4 generáció ujjlenyomatai ebből a szempontból nem informatívak, mivel mindkét szülő rendelkezik a d fragmenttel, és a IV 5-8 generációban pedig rekombinánsok is előfordulnak (a IV 7-8 egypetéjű ikrek). Ennélfogva az a-c csoport és a d fragment közti kapcsoltság bizonyítottsága gyenge (0-10 cM, p-0,01). Az anyai eredetű e sáv (a 33.6 próbával készült), illetve f sáv (a 33.15 próbával készült), szintén szoros kapcsoltságot mutat mind II 4 és II 5 utódainál, mind a további, egymással rokon ül 15-20 és IV 17-22 generációkban (20 informatív utód, nincs rekombináns, 6-0 cM, p-10"6). Mivel a 33.6 és a 33.15 próbák más miniszatellit-régiókat ismernek fel, és nem történt kereszthibridizáció az e és f fragmentek esetén, ezek a fragmentek autentikus példaként szolgálnak két különböző fókusz . kapcsoltságára. Végezetül, a két kapcsoltságot mutató csoport (a-c és e-f fragmentek) nem egy-egy fókusznak - az alléljai. A HI 1 személy heterozigóta hordozója mind az a-c csoportnak, mind az anyai e-f párnak. Mindkét csoport két gyermekének adódott át a négy közül, ez azt bizonyítja, hogy nem alléi szegregációról van szó, hanem a fenti csoportok két nem kapcsolt hipervariábilis régióból származnak. A II 5 anyai miniszatellit-fragmentek közül egyik sem mutatott szignifikáns kapcsoltságot a ß-thalassaemia jellemzőjével, ennélfogva nincs közeli kapcsoltság a 11-es kromoszóma ß-globin-göncsoportjäval sem. Ezzel szemben a 8,6 kilobázisos g anyai fragment 7 közvetlen leszármazottban és 3 kiértékelhető unokanemzedékben koszegregált a HPFH-val (lásd 9. ábra). Nem volt rekombináns a 12 leszármazott között, ami igen szoros kapcsoltságot sejtet (6-0 cM, p-2«10~4). Annak ellenére, hogy a II 5 egyénnél 17 különböző fókuszt vizsgáltunk egyidejűleg, a kapcsoltság még mindig szignifikáns (0,004 annak a valószínűsége, hogy a 17 figyelembe vett fókuszok egyikének allélja véletlen koszegregációt mutasson a HPFH-val). További vizsgálatokkal bizonyítottuk, hogy a II 5 egyén g fragmentje egyetlen miniszatellit-allélt képvisel, és nem két egymásra került DNS-fragmentum. A 9. ábrán bemutatott összes egyén DNS-ujjlenyomatát előállítottuk úgy is, hogy DNS-üket HinfI helyett Sau3A enzimmel emésztettük. Minden g-re pozitív DNS-ujjlenyomat rendelkezett egy g fragmentnek megfelelő hasonló méretű (8,6 kB helyett 8,2 kB) Sau3A fragmenttel, ami arra utal, hogy egyetlen miniszatellit- fragmentumról van szó. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 21
