203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 nyomat mintázata nagymértékben független attól, hogy milyen 4 bázispárt felismerő restrikciós endonukleázt használunk. Ebből nagy valószínűséggel következik, hogy ezek a nagy fragmentumok nem még hosszabb miniszatellit-fragmentumok hasítási termékei, hanem mindegyik egy teljes, hosszú miniszatellit-régiót tartalmaz, melyekben nem található restrikciós hasítási hely, és ezeket a régiókat olyan DNS-szakaszok szegélyezik, amelyekben a humán DNS-re általánosan jellemző, nagy sűrűséggel fordulnak elő 4 bázispáros restrikciós hasítási helyek. Ez a megállapítás összhangban van a korábbi példákban bemutatott eredményekkel, valamint a 8. példa adataival, amely bemutatja, hogy a legtöbb ilyöl nagy miniszatellit-fragmentum nem kapcsoltan öröklődik, és függetlenül szegnegálódik a családfán belül. A találmány szerint előnyösen minden DNS-mintáról kétszeres „ujjlenyomatot” készítünk: két különböző hibridizációs próba felhasználásával, a két hibridizációs kísérlet különböző DNS-ujjlenyomatokat eredményez, alkalmas erre például a 33.15 és 33.6 jelű fragmentumokból készített hibridizációs próbák kombinációja. Ily módon annak - eleve csekély - valószínűsége, hogy két nem rokon egyén DNS-ujjlenyomata azonos lenne, tovább csökkenthető. A 4. példa szerint például, ennek valószínűsége 1019, még abban az esetben is, ha a nehezen azonosítható, 4 kilobázisnál kisebb fragmentumokat előnyösen számításon kívül hagyjuk. A találmány tárgyát képezi továbbá egy apasági vizsgálati eljárás is. Egy utód polimorfikus miniszatellit-fragmentumainak kb. fele az apától származik, és ezek az apai fragmentumok az anya és az utód DNS- ujjlenyomatának összehasonlítása alapján azonosíthatóak. Általában valamennyi így azonosított apai fragmentum megtalálható az apa DNS-ujjlenyomatában. Becslések szerint annak valószínűsége, hogy egy utód 33.15 jelű hibridizációs próbával készített DNS-ujjlenyomatából azonosított, mind a - 4 kilobázisnál nagyobb - apai DNS-fragmentum véletlenül szerepeljen a feltételezett apa DNS-ujjlenyomatában, nagyságrendileg lO-5, és amennyiben mind a 33.6, mind a 33.15 jelű hibridizációs próbát alkalmazzuk, ez a valószínűség 10"8 nagyságrendűre csökken. Természetesen egy adott esetben a pontos valószínűség a kapott DNS-ujjlenyomat feloldóképességétől és összetettségétől függ, de a kapott valószínűség tovább növelhető (illetőleg csökkenthető) hogyha 4 kilobázisnál kisebb apai fragmentumokat is figyelembe veszünk, vagy pedig harmadik hibridizációs próbát is felhasználunk. A DNS-ujjlenyomat készítéséhez szükséges mennyiségű DNS (0,5-5 pg) gyorsan előállítható egyetlen csepp emberi vérből is. Ily módon több véletlenszerűen kiválasztott emberről készítettünk DNS-ujjlenyomatokat, ezek között volt két olyan személy, akikről megelőzőleg már készült DNS-ujjlenyomat, és volt közöttük két leánytestvér is. A készített DNS-ujjlenyomatok vizsgálata alapján könnyen és egyértelműen azonosítani tudtuk a két ismert DNS-ujjlenyomatú személyt, ugyanígy a két leánytestvért is, akiknek nagyszámú közös miniszatellit fragmentum volt található a DNS- ujjlenyomatukban. Egy adott személy esetén egy egész sor különböző sejtből lehet DNS-t izolálni, s az összes DNS-minta teljesen azonos DNS-ujjlenyomatot ad. Dy módon például a spermiumból és vérből készített DNS-ujjlenyomat egymástól megkülönböztethetetlen, csakúgy, mint az egypetéjű ikrek DNS-ujjlenyomata. Ezenfelül úgy tűnik, hogy az ujjlenyomatok DNS-mintázata változatlanul fennmarad sejttenyészetekben, amint az látható is, ha összehasonlítjuk egy adott személy vérből izolált DNS-ének ujjlenyomatát az ugyanezen személytől származó, Epstein-Ban vírussal transzformált limfoblasztoid sejtvonalból készített DNS- ujjlenyomattal. A találmány tárgyát képező eljárás a következő állatfajokra is alkalmazható: a legtöbb emlősre, madarakra, kétéltűek» és halakra. A vizsgált példák a következők: csirkék, hörcsögök, nyulak, egerek, verebek, vércsék, békák, tarajos gőték, halak. Csirkék esetén rendkívül komplex, kenődött hibridizációs mintázatot kaptunk. HaelII restrikciós endonukleázzal történő emésztéssel megszüntethető volt a kenődés, és előtűnt a „tiszta” ujjlenyomat. Ebből az következik, hogy a csirke-DNS valószínűleg tartalmaz egy hosszú, „core”-tartaImú szatellitet, melynek ismétlődő egységében található egy vagy több Haein hasítóhely, ezért a HaelII emésztés ezt a szatellitet olyan kisméretű fragmentumokká darabolja, melyek az elektroforézis során kifutnak a gélből. Valószínű, hogy egyéb állatok DNS-ujjlenyo-~ mataiban is előfordulhat hasonló kenődés, amely meg-. ■ felelő enzimekkel - melyek a hosszabb fragmentumo- ■ kát elhasítják - történő emésztéssel megszüntethető. A következő további példákban a hőmérsékletek *C- ban vannak megadva. 3. példa Friss humán placentából DNS-t izoláltunk A. J. Jeffreys módszere szerint (Cell 18, 1-10, 1979). Három különböző placentát használtunk, 1-3 jellel ellátva. 8 pg-os DNS-mintákat HinfI és/vagy Sau3 A emésztésnek vetettünk alá, 4 mM spermidin-triklorid jelenlétében, a teljes emésztés elősegítése érdekében; a DNS- mintákat fenolos extrakciót követő etanolos kicsapással tisztítottuk, majd 20 cm hosszú, 0,6%-os agarózgélben 30 V feszültséggel, kb. 24 órán keresztül elektroforetizáltuk, egészen addig, míg minden 1,5 kilobázisnál kisebb méretű fragmentum ki nem futod a gélből. A DNS-mintákat ezután, blott eljárással, Sartorius nitrocellulóz filterre vittük át Nagy specifikus aktivitású (nagyobb, mint 109 cpm 32P/pg DNS), egyes szálú M13 DNS hibridizációs próbákat állítottunk elő az 1. példa 4. pontjában leírtak alapján. Konkrétan a következő hibridizációs próbákat használtuk: (a) a 33.5 jelű próbát amely egy 220 nukleotidhosszúságú HaelII fragmentumból tdlt, amely csaknem egészében tartalmazza a X.33.5 jelű miniszatellitet (17 nukleotid»14 ismétlődés), valamint 60 nukleotidnyi emberi eredetű szegélyezőrégiót, a fragmentum az M13mp8 fág Smal helyére volt szubklónozva; (b) a 33.6 jelű próbát, amely egy 720 nukleotidhosszúságú HaelII fragmentumból 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
