203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 állt, amely a megfeleli miniszatelliten kívül kb. 50 nukleotidnyi humán eredeti szegélyezőrégiót tartalmazott, az M13mp8 Smal helyére szubklónozva; és (c) az 1. példa 4. pontjában leírt 33.15 jeli próbát, amely egy 592 nukleotidos Pstl-Ahaül fragmentumból állt, amely a megfelelő miniszatelliten kívül 128 nukleotid emberi eredeti szegélyező DNS-t tartalmazott, az M13mpl9 fág Pstl+Smal helyeire szubklónozva. A Southern blott hibridizációt az 1. példa 4. pontjában a C-E filterekre megadott körülmények között, 65 'C-on l*SSC-ben hajtottuk végre. A filtereket szobahőmérsékleten, erősítőfólia nélkül, 4 napig autoradiografáltuk. Mindegyik hibridizációs próba különböző mintázatot eredményezett, melyek összetettsége nagyban független volt attól, hogy milyen 4 nukleotidos felismerőhelyi enzimmel emésztettük a DNS-mintáL A kapott mintázatokat a 3. ábrán láthatjuk. A 4 kilobázisnál rövidebb polimorfikus fragmentumok azonosíthatóságát HinfI-Sau3A kettős emésztéssel növeltük, mivel így a háttér-hibridizáció megszüntethető volt, melyet valószínűleg olyan különböző hosszúságú és invariáns HinfI miniszatellit-fragmentumok okoztak, melyeknek egy vagy több ismétlődő egysége tartalmazott Sau3A hasítóhelyeket. A kettős emésztés segítségével a 33.15 jeli próba által azonosított polimorfikus fragmentumok száma személyenként kb. 15-IŐ1 kb. 23-ra volt növelhető, ugyanakkor a kettős emésztés az egyszeres emésztés során keletkezett hosszú miniszatellit- fragmentumok kb. 20%-át megszüntette, melyek valószínűleg a legtöbb - vagy az összes - ismétlődő egységükben tartalmaztak Sau3A hasítóhelyet. 4. példa Véletlenszerűen kiválasztott, 20 nem rokon, kaukázusi eredeti brit állampolgár véréből származó DNS-minták 8-8 pg-ját HinfI emésztés után, Southern blott hibridizációnak vetettük alá a 33.6 és 33.15 jeli miniszatellit-hibridizációs próbákkal, a 3. példában leírtak szerint. Mindegyik kapott DNS-ujjlenyomatot (A személy) összehasonlítottuk a vele szomszédos gélsávban készült ujjlenyomattal (B személy), és meghatároztuk az A sávban jelen lévő, de B sávból hiányzó fragmentumok, valamint az A és B sávban hasonló helyen meglévő, közel azonos autoradiográfiás intenzitást mutató fragmentumok számát. Az összes ilyen összehasonlításból kapott eredmények átlaga a következő táblázat- 5 ban látható. Az A sávokban találtunk néhány (kb. 6%) olyan gyengén hibridizáló csíkot, mellyel a B sávokban azonos helyen erősen hibridizáló csík volt látható. Mivel az ilyen esetekben nem megállapítható, hogy az A sávban látható halvány csík valójában jelen van-e B 10 sávban is (elfedve), vagy nem, az ilyen fragmentumokat a számításnál nem vettük figyelembe. Amennyiben az A és B sávokban együtt mozgó csíkok minden esetben ugyanazon miniszatellit-lókusz azonos alléljeitől származnak, akkor annak átlagos valószínűsége (x), 15 hogy egy A-ban jelen lévő fragmentum B-ben is megtalálható, a következő összefüggést mutatja az átlagos allélgyakorisággal (homozigoticitás: q): x-2q-q2, ahol: q-l-(l-x)1/2. A gyakorlatban az együtt mozgó csíkok egy bizo- 20 nyos (ismeretlen) hányada különböző miniszatellit-lókuszból származik, azért a fenti becsléssel a maximális allélgyakoriságot, illetve homozigoticitást kaphatjuk meg, amely érték ennek értelmében a miniszatellitfragmentumok elektroforetikus megkülönböztethetősé- 25 gének is függvénye. A 2. táblázatban megadott valószínűségek csak a megadott mérettartományba tartozó fragmentumokra vonatkoznak, így ahhoz, hogy az egész jól értékelhető mintázatra, (azaz a 4 kilobázisnál nagyobb fragmentu- 30 mokra) vonatkozó, átlagos valószínűségeket kapjunk, a három megadott értéket kombinálnunk kell. Ezért annak átlagos valószínűsége, hogy például A személy, 33.15-ös próbával készített, DNS-ujjlenyomatának minden egyes fragmentuma B személy hasonlóan ké- 35 szített ujjlenyomatában is jelen van, a kővetkezőképpen számítható: 0,08J'9•0,203■1 * *•0,27Í•7 *-3•10■,,. Annak a valószínűsége pedig, hogy az A személynél, a 33.15 és 33.6 jelű hibridizációs próbákkal egyaránt elkészített ujjlenyomatokban azonosított vala- 40 mennyi fragmentum megtalálható B személy hasonló ujjlenyomataiban is: 5*10'19. 2. táblázat Hibridiz. próba DNS-fragm. mérete, kilobázis Személyenként előford. fragm. sz. + S.D. Annak valósz. (x), hogy az A-ban jelen levő fragm. B-ben is van Max. átlagos allélgyakoriság (homozigoticitás) 33.6 10-20 2,8±1,0 0,11 0,06 6-10 5,1±1,3 0,18 0,09 4-6 5,9±1,6 0,28 0,15 33.15 10-20 2,9±1,0 0,08 0,04 6-10 5,1±1,1 0,20 0,11 4-6 6,7±U 0,27 0,15 14
