203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 tűk és mostuk. A filtereket 1-3 napig, erősítő fólia („fast tungstate”) jelenlétében -80 °C-on autoradiografáltuk. Amint az a 2. ábrán látható, a 33.15 jelű, „core”-ismétlődéseket tartalmazó próba segítségével HinfI emésztett humán DNS-ben, hibridizáló fragmentumok rendkívül összetett mintázatát lehetett kimutatni. Csak a legnagyobb (4-20 kilonukleotid nagyságú) fragmentumokat lehetett teljesen elkülöníteni egymástól, és ezek olyan mértékű, rendkívüli polimorfizmust mutatnak, hogy a hibridizációs mintázat egyénre jellemző, DNS „ujjlenyomatnak” tekinthető. A családfavizsgálat megerősítette a rendkívüli polimorfikus variáció tényét, amely olyan nagymértékű, hogy még egy elsőfokú unokatestvérek között kötött házasságból származó gyermekek (2. ábra, 16-18) DNS „ujjlenyomata” is különbözik egymástól. A 2. ábrán (D, E) bemutatott családvizsgálatokból kitűnt, hogy a legtöbb nagy HinfI fragmentum mindkét szülőtől csak bvizonyos utódoknak adódott át, amiből az következik, hogy a legtöbb ilyen fragmentum heterozigóta állapotú, valamint az, hogy ezen nagy, hipervariábilis fragmentumok heterozigoticitása meg kell hogy közelítse a 100%-ot. Fordított megközelítésben: az utódokban található összes ilyen fragmentum (összesen egy kivételtől eltekintve) visszavezethető az egyik, vagy a másik szülőre, ily módon ezek a fragmentumok egy stabilan öröklődő, genetikai markerkészletet alkotnak. Egyetlen fragmentum sem adódik át specifikusan apáról fiúra, vagy apáról lányra (lásd 2. ábra D filter). Ez kizárja a fragmentumok Y, illetve X kromoszómához való kapcsoltságát, és megerősíti azt a feltételezést, hogy ezek a miniszatellit-fragmentumok főleg autoszomális eredetűek. Az még nem tisztázott, hogy az autoszómakészleten belül honnan erednek ezek a DNS-fragmentumok, az azonban biztos, hogy nem egy bizonyos autoszóma egy meghatározott régiójából. Kimutathatók ugyanis olyan szülői ftagmentumpárok, melyek az utódokban függetlenül szegregálódnak (lásd D filter, 2. ábra). Pontosabban fogalmazva: az egyik szülőnél megtalálható olyan AB fragmentumpár, ami a másik szülőnél hiányzik, nem lehet allelikus pár, amennyiben található legalább egy AB vagy — utód; az A- vagy -B rekombináns leszármazottak megjelenése pedig tovább valószínűsíti az A és B fragmentumok közötti szoros kapcsoltság hiányát. A 2. D ábrán bemutatott, eredeti autoradiogramm alapos vizsgálata lehetővé teszi, hogy a fenti kritériumok alapján, az anyától származó DNS-„ujjlenyomatban” azonosítsunk legalább 10 sávot, melyek közül 8 páronként nem allélikus és nem mutat szorosan kapcsolt öröklődést A két másik sáv bármelyike lehet a 8 nem kapcsolt fragmentum közül valamelyik alléi párja, mivel ezekre vonatkozóan csak A- és -B leszármazottakat találtunk, mivel azonban a leszármazottak száma nem elég nagy, ez a megállapítás nem bizonyíthatja, hogy a vizsgált fragmentumpárok valóban egy lókuszban található alléi párok-e. Mindebből az következik, hogy a felhasznált, „core”-ismétlődéseket tartalmazó hibridizációs próba képes egyidejűleg hasznos információt szolgáltatni legalább egynéhány különböző, nem kapcsoltan öröklődő hipervariábilis lókuszról. Ezt a következtetést részletesen megvizsgáljuk a 8. példában. Ezzel szemben a találmány tárgyát nem képező másik két hibridizációs próba (2. ábra A és B filterek) csak egy-két hibridizáló fragmentumot eredményezett, és jól láthatóan nem alkalmas arra, hogy egyidejűleg azonosítson több különböző polimorfíkus régiót, s így ezeknek nincs általános diagnosztikai jelentőségük. 2. példa További variáns („core"-t tartalmazó) hibridizációs próbák felhasználása a humán DNS újabb hipervariábilis régióinak kimutatására. Két további hibridizációs próbát állítottunk elő a 733.5 és 733.6 jelű klónozott 733-pozitív fragmentumokból, az 1. példa (4) pontjában leírtak szerint. A 33.5 jelű hibridizációs próba egy M13 mp 8 fágban klónozott 308 nukleotidhosszúságú DNS-fragmentumból állt, amely a fent bemutatott konszenzus-szekvencia 14-szeres ismétlődését tartalmazta, amely valójában a közös „core”-szekvencia 17 nukleotidhosszúságú változata, valamint 70 nukleotidnyi humán eredetű szegélyező DNS-t A 33.6 jelű próba egy 37 nukleotidhosszú egység 18-szoros ismétlődését tartalmazta, az ismétlődő egység pedig egy kb. 12 nukleotidos szekvenciarészlet 3-szoros. ismétlődéséből és egy járulékos, az 5’ végi TC-szekvenciából állt (a 12 nukleotidos belső mag a közös „core” rövidített változata volt). A 18*37 nukleotidból álló ismétlődő blokkot 95 nukleotidnyi humán eredetű DNS szegélyezte. A 37 nukleotidos ismétlődő egység szerkezete a következő képpel adható meg: TGG AGG AGG GGC TGG AGG A-G GGC (vagy TGG AGG AGG G-C) TCCGG AGG AGG GGC. Ezt a hibridizációs próbát is M13mp8 fágban klónoztuk. A továbbiakban ezt a próbát a következő, 11 nukleotidból álló konszenzus-szekvenciával jellemezzük: AGGGCTGGAGG. Mindkét próbát - az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint - 32P-vel jelöltük, majd 14 nem rokon, kaukázusi eredetű brit állampolgártól származó DNS-mintákkal hibridizáltattuk. Mindkét próbával hibridizáló fragmentumok összetett mintázatát sikerült azonosítanunk, s az azonosított fragmentumok közül sok, rendkívüli polimorfíkus variációt mutatott. A 33.5 jelű próbával azonosított fragmentumok közül néhány új volt, abban az értelemben, hogy ezeket a 33.15 jelű „core"-hibridizációs próba nem mutatta ki. A 33.6 jelű próba egy csaknem teljesen új miniszatellit-családot mutatott ki, melyek pontos öröklődésmenetét családfa-analízissel derítettük fel (lásd 8. példa). A további példák méginkább bemutatják és alátámasztják a találmány hasznosíthatóságát. A DNS-minták emésztését előnyösen olyan restrikciós endonukleázzal hajtjuk végre, melynek 4 bázispáros felismerőhelye van. Azt találtuk, hogy a leghoszszabb hipervariábilis fragmentumok esetén az ujjle-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Í 12
