203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 1. táblázat Polinukleotid „Core’ '-hosszúság Képlet sz. %-os homológia Az ismétlődő egység hossza J+K n A találmány tárgyát képezi-e 33 bp mioglobin 16 2 100 33 17 4 X 33.1 16 2 81 62 46 26 X 33.3 16 2 100 32 16 6 X 33.4 16 2 75 64 48 14 X 33.5 16 4 100 17 1 14 y 33.6 11 5A4B 100 18 0 18 v/ 33.10 15 2 88 41 26 5 X 33.11 16 2 94 33 17 3 X 33.15 16 3 100 16 0 29 y az aláhúzott számok nem megengedett hoszzúságot jelölnek (4) Annak felismerése, hogy az egyes X33-pozitív 20 fragmentumokból készített hibridizációs próbák segítségével, polimorfikus humán genomi DNS-fragmentumokat lehet azonosítani. Ahogy az a 2. ábrán látható, hat nem rokon kaukázusi eredettl brit állampolgár fehér vérsejtjeiból DNS-t 25 izoláltunk (1-6), s hasonlóképpen egy nagy, ázsiai eredetű brit család kűlönbözd tagjaitól származó mintákból is (7-18). A családfában a szokásnak megfelelően a férfiakat négyzettel jelöltük, a nőket körrel, és a körök és négyzetek közötti vonalak házasságot jelentenek. 30 Két, első unokatestvérek között kötött vérfertőző házasságot a partnereket összekötő kettős vonallal jelöltünk. A DNS-mintákból 10-10 pg-ot HinfI emésztésnek vetettünk alá, 20 cm hosszú, 1%-os agarózgélben elektroforetizáltuk őket, in situ denaturálást hajtottunk 35 végre, majd a mintákat blott eljárással Sartorius nitrocellulóz filterre vittük át. Miniszatellit (tandemismétlőd<5) régiókat tartalmazó, rekombináns Ml3 fágokból, 32P jelzett, egyes szálú hibridizációs próbákat állítottunk elő. Az alkalmazott hibridizációs próbákat a ké- 40 sőbbiekben pontosan jellemezzük. A hibridizációs próbákat az alábbiak szerint állítottuk elő. Körülbelül 0,4 pg egyes szálú M13 DNS-hez 4 pg 17-tagú szekvenciáző primer oligonukleotidot hibridizáltattunk (M. L. Duckworth és mtsai, Nucleic Acids Res. 9,1691-1706, 45 1981) 10 pl 10 mM MgCh-ot tartalmazó - 10 mM-os Tris-HCl (pH 8,0) pufferben, 60 *C-on, 30 percig. A reakcióelegyhez a primer meghosszabbítás céljából hozzáadtunk: 16 pl 80 pM dATP-t, 80 pM dGTP-t, 80 pM dTTP-t, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-t és 0,1 mM 50 EDTA-t tartalmazó elegyet, valamint 3 pl (30 pCi) a-32P-dCTP-1 (3000 Ci/mmól) és 1 pl 5 egység/pl-es Klenow enzimet (Boehringer), és az elegyet 15 percig 37 *C-on inkubáltuk. A láncnövekedés befejeződését 2,5 pl 04 mM-os dCTP hozzáadása után, további 15 55 perces, 37 'C-on történő inkubálással segítettük elő. (Ez az ún. „chase”-reakció lehetővé teszi, hogy az egyes szálú M13 templátokon teljes hosszában megszintetizálódjék a komplementer DNS-szál.) Ezután a fág DNS-t egy megfelelő restrikciós endonukleázzal 60 hasítottuk, vagy az inszerten belül, vagy az M13 polilinker inszerten túli régiójában, a kapott lineáris DNS- mintát 1/10 térfogat 1,5 M NaOH hozzáadásával denaturáltuk, majd a primer meghosszabbításaként keletkezett 32P jelzett, egyes szálú DNS-fragmentumot 1,5%os, alacsony olvadáspontú agarózból (Sea Plaque) készült gélben történő elektroforézis útján izoláltuk. A gélből kivágott DNS-sávot (specifikus aktivitás >109 cpm/pg DNS) 1 mg lúgosán hidrolizált humán placenta carrier (hordozó) DNS jelenlétében, 100 °C- on megolvasztottuk, majd közvetlenül a hibridizációs kamrához vittük. (A carrier DNS hidrolízise 0,3 M NaOH és 20 mM EDTA jelenlétében, 100 *C-on, 5 percig történt, majd a mintát HCl-dal semlegesítettük.) A carrier DNS a későbbiek során, a hibridizációs próba repetitív DNS-szekvenciákhoz történő hibridizációját is szupresszálta. Az alkalmazott hibridizációs próbák pontos specifikációja a következő: (A) 33.1: egy körülbelül 2000 nukleotidhosszúságú szubklónozott HaelII fragmentum, amely egy miniszatellit régiót (egy 62 nukleotidból álló ismétlődő egység 26-szoros ismétlődését-1612 nukleotidot) és körülbelül 350 nukleotidnyi humán eredetű szegélyező DNS-t tartalmazott; (B) 33.4: egy 695 nukleotidhosszúságú nem-miniszatellit EcoRI fragmentum, amely egy 2015 nukleotidhosszúságú HinfI fragmentumon klónozott miniszatellit, primer közeli régióját tartalmazta; és (C, D, E) 33.15: egy 592 nukleotidhosszúságú szubklónozott fragmentum, amely a X33.15 fág miniszatellit-régióját (egy 16 nukleotidos szekvenciarészlet 29-szeres ismétlődését, ahol az ismétlődő régió átlagosan 2 nukleotidban tér el a fent bemutatott közös „core”-szekvenciától), valamint 128 nukleotidnyi humán eredetű, szegélyező DNS-t tartalmazott. A hibridizációs kísérleteket Jeffreys és mtsai módszere szerint végeztük (Cell 21,555-564,1980), azzal a különbséggel, hogy dextránszulfát helyett 6%-os (vegyes százalék) polietilénglikol 6000-et használtunk a háttér-jelölődés csökkentése érdekében. Az A és B filtereket egy éjszakán keresztül 04*SSC oldatban 65 *C- on hibridizáltattuk, majd 0,2*SSC-ben 65 *C-on mostuk. A C-E filtereket 65 °C-on l»SSC-ben hibridizáltat-11
