203790. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dipeptidek előállítására enzimatikus úton
A tiszta terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, vákuumban bepároljuk, majd fagyasztva szárítjuk. 3.5 g (12 mmól, 48%) D,L-fenilalanin-metionint kapunk, fehér, amorf por formájában. Enzimkészítmény stabilitása A kísérletet ugyanazzal az enzim-gél-készítménnyel többször megismételhetjük, a konverzió csökkenése nélkül, összehasonlítható eredményekkel. Az enzim tehát megfelelően stabil a reakciókörülmények között, ami az eljárás gazdaságosságát még jobban növeli. Termék azonosítása A termék kloridmentes, de 7,0 tőmeg% acetátot tartalmaz, tehát részlegesen acetátformában van. Az aminosav-analízis eredmények szerint nincs szabad aminosav, és savas hidrolízis után a következő eredményt kapjuk: Met (0,98), Phe (1,03). [a]ÿ--128,9* (c-0,25, víz). Termék tisztasága HPLC-tisztaság: 99,6% (nukleosile 7 Cu, 0,1 mól/1 ammónium-foszfát, pH 3/acetonitril, 220 nm). Víztartalom Karl Fischer szerint: 2,8%. 21. példa DJD-Fenilalanil-fenilalanin-etil-észter-hidrogén-klorid (DJD-phe-Phe-OEt’HCl) preparatív szintézise 2.5 g (11 mmól) D-fenilalanin-etil-észter-hidrogénkloridot 45 ml vízben oldunk, és hozzáadunk 0,5 ml 0,1 n EDTA-oldatot. A pH-t nátrium-hidroxid-oldattal 9,0-re állítjuk, a szubsztrát a reakció megindításakor részben olajos szuszpenzió formájában van. A reakciót 3,4 ml, 20 mg/ml koncentrációjú karboxipeptidáz-Y- oldat hozzáadásával indítjuk, és a reakcióelegyet 2,5 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, a pH-t nátrium-hidroxid-oldattal 9,0 értéken tartjuk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy a pH-t hidrogén- klorid-oldattal 3-ra állítjuk. A reakcióelegyet szűrjük, és R-preparatív HPLC eljárással tisztítjuk, a 16. példában leírtak szerint. A terméket tartalmazó frakciókat vákuumban bepárolva koncentráljuk, és hidrogén-klorid-oldat hozzáadásával fagyasztva szárítjuk. 0,49 g (1,3 mmól, 12%) cím szerinti vegyületet kapunk, amorf por formájában. Azonosítás A termék 9,2 tömeg% kloridot tartalmaz, acetát nem mutatható ki, a termék hidrogén-klorid-só formájában van. Az aminosav-analízis savas hidrolízis után fenilalanint mutat, míg a savas hidrolízis előtt nem mutatható ki fenilalanin. A terméket bázissal tovább hidrolizálhatjuk, a hidrolízis terméke kromatográfiásan különbözik a D,L-Phe- Phe-OH-tól, és a termék maga L,L-Phe-Phe-OEt standarddal együtt eluálódik az alkalmazott HPLC-rendszetben. [ot]í?—42,7* (c-0,5, ecetsav). A tiszta, standard L,L-Phe-Phe-OEt esetén [ct]ÿ-+52,l* (c-0,5, ecetsav). Az eltérés ebben az esetben a szintetizált peptid kisebb tisztaságának tulajdonítható. Tisztaság HPLC-tisztaság: 82,3% (nukleosile 7 Cu, 0,1 mól/1 ammónium-foszfát, pH 3/acetonitril, 220 nm). A kimutatott szennyeződések a szubsztráttól, a szubsztrát hidrolízis-termékétől, a termék hidrolízistermékétől és azok diasztereomerjeitől eltérőek. Víztartalom Karl Fischer szerint: 7,5%. 22. példa D-tirozil-$-alanin preparatív szintézise D-tirozil-$•alanin-metil-észteren keresztül, enzimatikus deblokkolással D-Tirozin-etil-észtert (1,07 g 5,1 mmól) és ß-alaninmetil-észtert (4,14 g, 40,1 mmól) oldunk 57 ml vízben, amely 60 pmól (22,3 mg) dinátrium-EDTA-t és 3 mmól (3633 mg) TRIS-t tartalmaz. A reakciót 3,40 ml karboxipeptidáz-Y (350 pmól/liter) oldat adagolásával indítjuk el, majd a reakció alatt a pH-értéket 83 értéken tartjuk. 2 óra elteltével a pH-értéket 1 mól/literes hidrogénklorid-oldat adagolásával 3,0 értékre állítjuk be. A reakciókeveréket 100 ml térfogatra hígítjuk, majd RP- preparatív HPLC-módszenel tisztítjuk (Waters Prep LC/System 500A) egy oszlopot (5,7*30 cm) felhasználva, melyet megtöltünk 60 pm C-18 részecskékkel és 50 mmól/liter ecetsav/etanol keverékkel. A nyersterméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson töményítjük, és végül fagyasztva szárítjuk. 0,78 g D-tirozil-ß-alanin-metilészter-acetátot (2,7 mmól, 58%) kapunk. Tisztaság HPLC-tisztaság: 98,0% (nukleosile 7 Cu, 0,1 mól/liter ammónium-foszfát, pH 3,0/acetonitril, 220 nm). Azonosítás Aminosav-analízis kimutatta, hogy a termék szabad aminosavakat nem tartalmaz és az alábbiakban részletezendő hidrolízis az alábbi eredményt szolgáltatta: ß-Ala (1,04) D-Tyr (0,96). Eljárás A dipeptid-metil-észtert (0,65 g, 23 mmól) 40 ml vízben oldjuk, amely 4 ml 03 mól/liter foszfátpuffert (pH 7,0) tartalmaz. A reakciót 2,8 ml sertésmáj észterázzal (Pig Liver Esteraser, rövidítve: PLE, 357 pmól/liter) adagolásával indítjuk el, majd a reakció lezajlása alatt a pH- értéket 7,0-en tartjuk. 4 óra elteltével a pH-értéket 10 mól/literes hidrogénklorid-oldat adagolásával 3,0 értékre állítjuk be. A reakciókeveréket 70 ml térfogatra hígítjuk, majd RP-preparatív HPLC-módszerrel tisztítjuk (Waters Prep 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
