203790. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dipeptidek előállítására enzimatikus úton
1 HU 203 790 B 2 LC/System 500A) egy oszlopot (5,700 cm) felhasználva, melyet megtöltünk 60 pm C\% részecskékkel és 50 mmól/liter ecetsav/etanol keverékkel. A nyersterméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson töményítjük, és végül fagyasztva szárítjuk. 0,50 g D-tirozil-p-alanin-metil-észter-acetátot (1,5 mmól, 65%) kapunk. Azonosítás Aminosav-analízis kimutatta, hogy a termék szabad aminosavakat nem tartalmaz és az alábbiakban leírt savas hidrolízis a következő eredményt szolgáltatja: ß-Ala (1,04) D-Tyr (0,96) HPLC-módszerrel kimutatott acetáttartalom: 1,21%. Kloridiont nem detektáltunk. Specifikus optikai forgatóképesség: -34,9' (c—0,01, 0,1 mól/liter HC1, nátrium D-vonalát felhasználva 2 0 °C-on). Tisztaság HPLC-tisztaság: 98,0% (nukleosile 7 Qs, 0,1 mól/liter ammónium-foszfát, pH 3,0/acetonitril, 220 nm). 23. példa ß-Alanil-L-metionin karboxipeptidáz-Y» katalizált szintézise, mely reakciót két eltérő pH-értéken vízben hajtottuk végre szubsztrátként ß-alanin-benzil-6sztert és nukleofilként szabad metioninsavat alkalmazva. Szubsztrát Nukleofil pH Kitermelés koncentráció (%) 25 mmól 0,4 mól/1 8,0 5* b) 25 mmól 0,4 mól/1 8,5 8 *> 50 pmól/liter CPD-Y, 2 mmól/1 Na2-EDTA b) 50%-nál kisebb koncentrációnál meghatározva. 24. példa Dipeptidek karboxipeptidáz*1 katalizált előállítása, mely reakciót vízben eltérő pH-értékeken hajtunk végre szubsztrátként D-aminosav-etil-észtereket és nukleofilekként amino-metil-foszfonsavat (AMP) és 2-amÍ- no-etil-szuflonsavat (2-AES) alkalmazva. Enzim Szubsztrát Nukleofil pH Kitér mêlés (%) CPD-Y L-Tyr-OEt (50 mmól/1) AMP (0,2 mól/1) 9,3 2 CPD-W L-iyr-OEt (50 mmól/1) AES (0,5 mól/1) 8,5 4b) » 20 pm CPD-W, 2 mmól/1 Na2-EDTA és 0,1 mól NH4CI (pH beállítva) b) 100-nál kisebb konverziónál, standarddal végzett hidrolízisre meghatározva. 25. példa L,L-Tyr-Val-NH2 karboxipeptidáz-Y katalizált előállítása, melynek során nagy szerves oldószer-koncentrációt, 8,5-es pH-értéket és szubsztrátként L-tirozin-etil-észtert és nukleofilként L-valinamidot alkalmazunk. Szubsztrát Nukleofil Oldószer» Kitermelés» koncentráció (%) 25 mmól/1 0,5 mól/1 92% glicerol 53 *> 80%-os konverziónál meghatározva, 100 pmól/liter CPD-Y, 2 mmól/liter Na2-EDTA. b) Az oldószer-koncentrációt a víz és a szerves oldószer arányaként határoztuk meg, miközben a szilárd részeket kizártuk az oldatból. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás az (I) általános képletű dipeptidek - a képletben A jelentése adott esetben oldalláncban védett L- vagy D-a-aminosav-maradék vagy o-aminosavmaradék, és B jelentése adott esetben oldalláncban védett L- vagy D-a-amino-karbonsav-maradék, amely A-val azonos, vagy attól eltérő lehet; L- vagy D-amino-szulfonsav- vagy D- vagy L-amino-foszfonsav-maradék, vagy a megfelelő w-aminosavak vagy azok sói vagy hidrátjai, és Y jelentése hidroxilcsoport vagy C-terminális védőcsoport -előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (II) vagy (III) általános képletű szubsztrátkomponenst - a képletekben A jelentése a tárgyi körben megadott, R1 jelentése hidrogénatom, egyenes vagy elágazó szénláncú, adott esetben hidroxilcsoporttal szubsztituált 1-4 szénatomos alkil- vagy benzilcsoport -, egy nukleofilkomponenssel reagáltatunk, amelyet abban az esetben, ha A-B, in situ is előállíthatunk, és amely (a) egy (IV) általános képletű aminosav - a képletben B jelentése egy, a tárgyi körben megadott aminokarbonsav -, vagy (b) egy (V) általános képletű aminosavamid - a képletben B jelentése egy, a tárgyi körben megadott aminokarbonsav -, vagy (c) egy (VI) általános képletű aminosav-észter - a képletben B jelentése egy, a tárgyi körben megadott aminokarbonsav, és R4 jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport -, vagy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
