203790. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dipeptidek előállítására enzimatikus úton
1 HU 203 790 B 2 A találmány tárgya eljárás dipeptidek és származékaik előállítására enzimatikus úton. Az utóbbi években egyre nagyobb az érdeklődés olyan dipeptidek vagy dipeptidszármazékok iránt, amelyek adott esetben egy D-konfigurációjú amino- 5 savmaradékot tartalmaznak, tekintettel ezek lehetséges gyógyászati hatásaira, például antibiotikum tulajdonságaikra. Hasonlóképpen nagy az érdeklődés dipeptidek iránt például a mesterséges élelmiszerek területén, úgy humán, mint állatgyógyászati alkalmazásban, édesítő- 10 szerként, valamint a mezőgazdaság területén, herbicidként. Az ilyen H-A-B-Y általános képletű dipeptideket ismert kémiai kapcsolási reakciókkal állíthatjuk elő, de ezekben a reakciókban általában a résztvevő - A 15 és B - aminosavakat amino-, illetve karboxilcsoportjukon védeni kell, és gyakran az oldalláncúkban esetlegesen jelen lévő funkciós csoportjaikon is. Ezért ebből adódóan nagy a mellékreakciók veszélye a kapcsolási reakciók során, a reaktánsok és az alkalmazott 20 reakciókörülmények miatt, a leggyakoribb mellékreakciók egyike a racemizáció, különösen az A-komponens racemizációja. A kémiai kapcsolási reakciót enzimatikus kapcsolási rakcióval helyettesítve, amely enyhe reakciókörülmények között megy végbe, az 25 ilyen mellékreakciók és racemizáció elkerülhetők, és a reakció eredményeként sztereokémiailag tiszta terméket kapunk. Az amino- és karboxilcsoportok védése feltétlenül szükséges a kémiai kapcsolási reakciókban, valamint 30 az endoproteázokkal végzett enzimatikus kapcsolásokban, és jelenlegi tudásunk szerint a szubsztrát aminocsoportján az enzimatikusan exoproteázzal katalizált dipeptidképződésnél is. Ez számos hátrányt jelent ezekben az eljárásokban, ami komolyan befolyásolja 35 gazdaságosságukat ipari méretekben, és ez különösen a dipeptidek szintézisében nyilvánvaló. A hátrány ezeknek a védőcsoportoknak a bevezetéséből adódik, valamint azok eltávolításából, és jelenlétükből a reakció során, ami a teljes eljárás költségét és 40 idejét növeli, és kihat az összhozamra is. Az általánosan használt amino-védócsoportok jellegzetes példái a karbobenzoxi- (Z-) és a terc-butiloxikarbonil- (Boc-) típusú csoportok, amelyek móltömege összemérhető az aminosav-maradékokéval. A védőcső- 45 portokat először megfelelő, drága szerek segítségével, egy külön reakciólépésben be kell vinni a kiindulási anyagokba, majd izolálni kell azokat. Ezeknek a hidrofób csoportoknak a jelenléte sokszor nagymértékben megváltoztatja a köztitermékek és reakciótermékek 50 oldhatóságát, és az eljáráshoz szükséges oldószereknek mind az anyagi minőségét, mind mennyiségét befolyásolhatja, továbbá kihathat a tisztítás és védőcsoport-eltávolítás végrehajtásának bonyolultságára is. A védőcsoport eltávolítása szintén egy külön reakciólépést 55 igényel, és ezt egy újabb tisztítási lépés követi. A fenti célokra számos reakció alkalmazható, de a katalitikus hidrogénezés kivételével - ami önmagában ipari méretekben nehézséget jelent - ezek az eljárások erősen, sokszor drasztikusan erős savas vagy bázikus körűimé- 60 nyék között mennek végbe, aminek következtében gyakran mellékreakciók játszódnak le, és ennek eredményeként a termék nem megfelelő tisztaságú lesz, vagy fáradságos tisztítási műveletekre van szükség. Ennek a meglehetősen hosszadalmas szintézisútnak utolsó lépése tehát egy meglehetősen viszonylagos védőcsoport-eltávolítás a kívánt pepiidről, továbbá - a szinte elkerülhetetlen mellékreakciók miatt - sokszor munkaigényes tisztítási műveletek kellenek ahhoz, hogy a kívánt terméket a megfelelő nagy tisztasággal kapjuk. Az amino-terminális csoport védésének elkerülésére a dipeptidek előállítása során mikrobiológiai fermentációs módszereket alkalmaznak, mint például a 074 095 és 102 529 számon közzétett európai szabadalmi leírásokból ismert eljárásban. Ezek az eljárások alapvetően különböznek a szintetikus eljárásoktól, és minden egyes peptid esetén specifikus organizmusokon alapulnak, ezért nem alkalmazhatók általánosan. Ezenkívül a hozamok gyakran alacsonyak, és a fermentációs tápközegből való visszanyerés gyakran igen munkaigényes. Ezért egy eljárás általános gazdaságossága szempontjából nyilvánvaló előnyt jelent a védőcsoportok alkalmazásának elhagyása, mind az amino-, mind a karboxilvégen. Találmányunk célja ennek lehetővé tétele dipeptidek szintézise során, szerin- és tiol-karboxipeptidáz katalízis segítségével. Bizonyos esetekben szükség lehet olyan eljárásra, amely lehetővé teszi oldalláncban védőcsoportot tartalmazó, de terminálisukon védőcsoport nélküli dipeptidek előállítását. A találmány szerinti eljárás alkalmas az ilyen vegyületek előállítására is, oldalláncúkban védőcsoportot tartalmazó, de amino-, illetve karboxil-terminálisukon védőcsoport nélküli kiindulási vegyületekből. Ebben az esetben is ugyanolyan enyhe reakciókörülmények között dolgozhatunk, és ugyanolyan összességében tekintve gazdaságos módon. Kívánt esetben az oldallánc védőcsoportját kémiai vagy enzimatikus eljárással lehasíthatjuk. Ismertek az olyan enzim-katalizálta kapcsolási reakciók, amelyek lehetővé teszik egy oldalláncában védőcsoportot nem tartalmazó aminosavszármazék és egy adott esetben C-terminálisán védetlen B-komponens (nukleofil) kapcsolását (például a 155 613 számú dán szabadalmi leírás, valamint a megfelelő, 17 485 számú európai szabadalmi leírás). A17 485 számú európai szabadalmi leírásban ismertetik az A-Bi-Zi általános képletű peptidek - a képletben Ai jelentése N-terminálisán védett aminosavmaradék, vagy egy, N-terminálisán adott esetben védett peptidmaradék, amelynek C-terminálisán egy L-aminosavmaradék van, B| jelentése L-aminosavmaradék, és Zi jelentése -OH vagy C-terminális védőcsoport - előállítását, egy szubsztrátkomponens és egy aminkomponens reagáltatásával, enzim jelenlétében, és kívánt esetben az adott esetben jelen lévő terminális védőcsoportok lehasításával, amelynek jellemzője, hogy egy 2
