203790. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dipeptidek előállítására enzimatikus úton
1 HU 203 790 B Ai-ORi, Ai-NRîRî’, vagy Ai- Xi-OH általános képlett! aminosav-észtert, peptid-észtert, depszipeptidet, vagy adott esetben N-szubsztituált aminosavamidot vagy peptidamidot, vagy adott esetben N-terminális védett pepiidet - a képletben Ai jelentése a fenti, Rí jelentése alkil-, aril-, heteroaril-, aralkilcsopoit vagy egy aminosavmaradék a-dezamino-fragmense, R2 és R2’jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkil-, aril-, heteroaril- vagy aralkilcsoport, és Xi jelentése L-aminosavmaradékegy H-Bi-NRsRj’, vagy H-B1OR4 általános képlett!, adott esetben N-szubsztituált L-aminosavamiddal, L-aminosawal vagy L-aminosavészterrel, mint aminkomponenssel (nukleofillel) - a képletben Bi jelentése a fent megadott, R3 és R3’jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, hidroxilcsoport, amino-, alkil-, aril-, heteroaril- vagy aralkilcsoport, és R4 jelentése hidrogénatom, alkil-, aril-, heteroaril- vagy aralkilcsoport -reagáltatnak, egy éleszti, vagy állati, növényi, vagy egyéb, mikrobás eredeti! L-specifikus szerin- vagy tiolkarboxipeptidáz enzim jelenlétében, pH 5 és 10,5 közötti vizes oldatban vagy diszperzióban, előnyösen 20 és 50 *C közötti hőmérsékleten. Előnyös enzim az élesztőből származó karboxipeptidáz Y, amelyet a továbbiakban CPD-Y-nak nevezünk. (Megjegyezzük, hogy a találmány szerinti szimbólumjelentésekkel való összetévesztés elkerülésére a fenti szimbólumok jelölése nem azonos a 17 485 számú európai szabadalmi leírásban alkalmazottakkal). A fentiek szerint tehát, ha az ismert eljárással állítunk elő egy dipeptidet, szubsztrátkomponensként kötelezően egy N-tenninálison védett aminosavszármazékot kell használnunk, és az aminosavkomponens kötelezően egy L-aminosav. Még nagyobb általánosságban megállapítható, hogy a szubsztrát komponens N-terminális aminocsoportja védésének szükségessége a peptidmaradék szénláncának növekedésével csökken, és lényegében nem kell védőcsoportot alkalmazni, ha a peptidmaradék 3 aminosavból áll, azonban ez azok típusától és szekvenciájától is függ. A fentieket Breddam és munkatársai ismertetik [„Influence of the substrate structure on carboxypeptidase Y catalyzed peptide bond formation”, Carlsberg Res. Commun., 45,361-367 (1980)], amikor is Ac-Ala-Ala-Ala-OMe-t és H-Ala-Ala-Ala-OMe- kapcsoltak H-Leu- NH2-dal, CPD-Y jelenlétében, és a reakció termékeként Ac-Ala-Ala-Ala-Leu-NH2-t, illetve H-Ala-Ala-Ala-Leu-NH2-t kaptak, 90, illetve 80% hozammal. Breddam és munkatársai megvizsgálták az aminosav konfigurációjának jelentőségét is a CPD-Y-katalizálta peptidszintézis hozamának szempontjából, az eredmények az alábbi táblázatban láthatók, ahol Alá L-alanint és ala D-alanint jelent. Szubsztrát Tennék Hozam (%) H-Ala-Ala-Ala-OMe H-Ala-Ala-Ala-Leu-NHj 80 H-Ala-ala-Ala-OMe H-Ala-ala-Ala-Leu NH2 40 H-Ala-Ala-ala-OMe H-Ala-Ala-ala-Leu NH2 0 Reakciókörülmények: 25 mmól/1 szubsztrát, 0,1 mól/1 KC1, 1 mmól/1 EDTA, pH 9,5, CPD-Y 12 pmól, 0,2 mól/1 Leu-NH2; a reakciót 20 perc elteltével állították le. A táblázat eredményeiből látható, hogy ha a C-terminális aminosav D-konfigurációjú, nem megy végbe a peptidszintézis, mivel az észter nem reagál (lásd H-Ala-Ala-ala-Leu-NH2). Ha a D-aminosav a C-terminálissal szomszédos aminosav (lásd H-Ala-ala-Ala-Leu-NH2), a reakció lejátszódik, de a kapcsolás hozama 40%-ra csökken, a tiszta L-konfigurációjú H-Ala- Ala-Ala-Leu-NH2 80%-os hozamához képest Ezenkívül régóta ismert, hogy néhány endoproteáz képes katalizálni bizonyos N-terminálison nem védett L-konfigurációjú aminosav-észterek oligomerizációját, azonban sohasem kísérelték meg ezt a tényt olyan dipeptidek előállításában alkalmazni, amelyek nem egy széni dimerek. Általában az ilyen irányú kísérletek eredményeként számos oligomer elegyéhez jutottak, amelyek közül néhány hosszú volt és csak termékkicsapás esetén volt lehetséges egyetlen terméket izolálni. A fenti okok miatt az endopeptidázokat csak amino- és karboxil-terminális védett kiindulási anyagok alkalmazása esetén használták peptidek szintézisére (például 4 086 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A fenti típusú kiindulási anyagokra van szükség abban az esetben is, ha aszpartát-endoproteázokat (lásd 3 972 773 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), vagy metallo-endoproteázokat használnak (lásd például a Z-Asp-Phe-OMe*Phe-OMe-só szintézisét a 99 585 számú európai közrebocsátási iratban). Végül a D,L-, L,D-, és D,D-konfigurációjú diasztereomer dipeptidek és a P-aminosavmaradékokat tartalmazó peptidek szintézise aminocsoporton nem védett kiindulási anyagokból nem volt megoldva sem karboxipeptidázokkal, sem általában egy proteolítikus enzimmel (EC 3,4 osztály). Kísérleteket végeztek egy másik enzimosztályba (EC 6,1) tartozó enzimmel, az aminoacil-t-RNS-szintetázzal (lásd 086 053 számú európai közrebocsátási irat). Ebben az esetben azonban minden egyes aminsavmaradék esetén egy specifikus enzimet kell használni, továbbá drága kofaktorok, például AXP kell a reakció lejátszódásához. Ugyanakkor a hozamok igen alacsonyak, és ahhoz, hogy a terméket izolálni és azonosítani tudják, általában a kofaktorból 10-szeres, a nukleofilből 100-szoros és az enzimből még 1000-szeres tömegfelesleget is kellett alkalmazni. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
