203789. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antikokcidiális és növekedést serkentő hatású policiklusos savas éter-típusú antibiotikumok előállítására
1 HU 203 789 B 2 - a tejet nem koagulálja és nem peptonizálja;- kazeinbontás pozitív;- tirozinbontás negatív;- kalcium-malát bontás negatív. Szénhidráthasznosítás: asszimilálja a glükózt, arabinózt, fruktózt, mannitot, ramnózt, szacharózt, xilózt, adonitot, cellobiózt, glicerint, maltózt, ribózt, keményítőt és trehalózt; nem hasznosítja az inozitot, raífinózt, dulcitot, eritritet, galaktózt, laktózt, mannózt, melecitózt, melibiózt, alfa-metil-D-glükozidot, szalicint, szoibitot és szorbózt. Más pozitív tesztek:- acetát- és piruváthasznosítás;- eszkulinhidrolízis és- xantin- és hipoxantinlebontás. A következő tesztek negatív eredményűek: benzoát-, citrát-, dextrin-, laktát-, malát-, mukát-, oxalát-, fenol-, propionát- és szukcináthasznosítás; adenin- és tirozinlebontás és hippuráthidrolízis. A hőmérsékleti viszonyok hatása 21 °C 28 °C 37 *C 45 *C jó növekedés jó növekedés jó növekedés jó növekedés Teljes sejtelemzés A teljes sejt hidrolizátuma a következőket tartalmazza: mezo-diamino-pimelinsav, glükóz, galaktóz, maduróz, mannóz és ribóz. Az N777-1 tenyészet jellemzői a következők:- krémszínű szubsztrátmicélium,- rövid, színtelen légmicélium,- rövid spóralánc, amely lehet egyenes, görbült vagy hurkolt és sima spórafelület. Hasznosítja a glükózt, arabinózt, fruktózt, mannitot, ramnózt, szacharózt, xilózt, adonitot, cellobiózt, glicerint, maltózt, ribózt, keményítőt, trehalózt, acetátot, és a piruvátot. Lebontja a xantint, hipoxantint és az eszkulint. A teljes sejthidrolizátumokban mezo-diamino-pimelinsav és maduróz van jelen. így az N777-1 tenyészet az Actinomadura genushoz tartozónak minősül, amint ezt H. Lechevalier definiálta. Az ismert Actinomadura speciesek közé tartoznak - hasonló krémszínű szubsztrátmicéliummal és/vagy hasonló biokémiai tulajdonságokkal, a következők: - A. cremea subsp. rifamycini, - A. madurae subsp. simaoensis és- A. routienii. Az N777-1 tenyészet a sima spórák, a nitrátredukáló-képesség hiánya, a raffinózhasznosítás hiánya és az arabinóz és a ramnóz hasznosítása tekintetében különbözik az A. cremea subsp. rifamycini-től. Az N777-1 tenyészet az A. madurae subsp. simaoensis-től abban különbözik, hogy a szubsztrátmicélium színtelentől narancsbama színével szemben inkább krémszínű; légmicéliuma inkább színtelen, mint színtelentől ibolyásfehérig terjedő színű; a nitrátot nem redukálja, a tirozint nem bontja el és képes a xantin lebontására. Az A. routienii-vel szemben a következő különbségek állapíthatók meg: pszeudosporangiumok nem képződnek; nem hidrolizálja a keményítőt; nem koaguláltatja a tejet; képes a mannit, fruktóz és a glicerin hasznosítására. Az N777-1 tenyészet a biokémiai tesztek többségének eredményei tekintetében hasonló az A. alboluteahoz, de a következő jellemzőkben eltér ettől: nem hidrolizálja a keményítőt; nem koaguláltatja a tejet; szubsztrátmicéliuma inkább krémszínű, mint bama-sötétbama; a spóraláncok inkább rövidek, mint hosszúak. Az előbbiekben bemutatott adatok alapján az N777- 1 tenyészetet az Actinomadura genushoz tartozónak tekintjük és „Actinomadura sp.”- ként jelüljük. Ezt a tenyészetet ATCC 53708 számon helyeztük letétbe az ATCC-ben, 1988. jan. 8-án. A találmány szerinti (I) antibiotikum könnyen előállítható oly módon, hogy ezt az Actinomadura sp.-t 24-36 °C hőmérsékleten süllyesztett körülmények között tenyésztjük, kevertetés és levegőztetés közben, a következő komponenseket tartalmazó táptalajokon:- szénhidrátforrások, mint cukrok, keményítők, glicerin;- szerves nitrogénforrások, mint szójaliszt, kazaminosavak, élesztőkivonat;- növekedést elősegítő anyagok, mint oldható maganyagok, halliszt, gyapotmagliszt;- ásványi sók, amelyek nyomelemeket - vas, kobalt, réz, cink stb. - tartalmaznak és- pufferként kalcium-karbonát vagy foszfátok. A tenyésztés befejezése után az antibiotikum kőnynyen kinyerhető oly módon, hogy a teljes fermentlevet egy szerves oldószerrel, így n-butanollal, metil-izobutil-ketonnal, vagy kloroformmal extraháljuk a 4,0-8,0 közötti pH-tartományban. A kicsapódott antibiotikumot tartalmazó micéliumot szüljük és a szűrletet elvetjük, vagy eljárhatunk úgy is, hogy a teljes fermentlevet porlasztva vagy fagyasztva szárítjuk. Egy másik megoldás szerint a micéliumot vagy a teljes szárított fermentlevet az említett szerves oldószerek valamelyikével extraháljuk. A tisztított antibiotikumot kívánt esetben a szokásos koncentrálási eljárásokkal - só- vagy szabadsav-képzés, kromatografálás, kicsapás és/vagy kristályosítás - különítjük el a szerves kivonatból, amint ezt a továbbiakban példákkal szemléltetjük. A fermentáció szokásos módon való végrehajtása esetén először inokulumot készítünk, oly módon, hogy lekaparjuk a vegetatív sejteket, amelyeket megfelelő táptalajokon, Actinomadura sp. ATCC 53708-cal beoltott ferde agarcsövekben vagy Roux-palackokban tenyésztettünk. A kapott vegetatív sejteket rázott lombikok vagy inokulumtankok beoltására használjuk fel, megfelelő táptalajok alkalmazásával. Egy másik megoldás szerint az inokulumtankokat rázott lombiktenyészettel oltjuk be. Megfelelő tenyésztési periódus után (ez általában 120-144 óra rázott lombikban és 168-196 óra inokulumtankban) ugyancsak megfelelő táptalajt tartalmazó fermentort oltunk be steril körülmények között a rázott 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
