203788. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin előállítására fermentálással
1 HU 203 788 B 2 A találmány tárgya eljárás L-lizin előállítására fermentálással. Az L-lizinnek sokféle alkalmazási módja ismeretes az állati takarmányok, gyógyszerek, élelmiszerek, stb. területén. Mind ez ideig az L-lizin előállítása olyan eljárások segítségével történt, melyek a glutaminsavat termelő, coryneform mikroorganizmusok számos különböző - tápanyagigényes, gyógyszerekkel szemben ellenálló, illetve gyógyszerekre érzékeny - törzseit használják fel. Ismeretes továbbá olyan eljárás is, melynek során antibiotikum-rezisztens törzseket alkalmaznak (3 687 810 számú amerikai szabadalmi leírás), valamint egy, a Bacillus törzshöz (genus) tartozó mikroorganizmusok által termelt antibakteriális anyagokkal szemben ellenálló törzseket felhasználó eljárás is (169 497/84 számú publikált, de nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés). Nem ismerünk azonban olyan közleményt, mely az iturinnal rokon anyagokkal szemben rezisztenciát mutató törzsekről számolna be. A Bacillus törzshöz (genus) tartozó mikroorganizmusok által termelt antibakteriális anyagokkal szemben ellenálló törzseket felhasználó eljárás - melyet az említett 169 497/84 számú publikált, de nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés tárgyal -, célja nem az, hogy fokozza a lizint termelő mikroorganizmusok által előállított lizin mennyiségét, hanem az, hogy megakadályozza a lizint termelő mikroorganizmusok szaporodásának - a Bacillus törzshöz (genus) tartozó mikroorganizmusokkal történt szenynyeződés miatt bekövetkező - gátlását. Olyan eljárás kifejlesztése vált tehát szükségessé, melynek segítségével alacsony, ipari áron állítható elő L-lizin. A találmány szerzői kiterjedt kutatásokat végeztek olyan eljárás kidolgozására, melynek során biztosítható az L-lizin előállítása fermentálással, annak érdekében, hogy lehetővé váljék az L-lizin alacsony, ipari árának elérése. A szerzők vizsgálataik során azt tapasztalták, hogy az L-lizint termelő mikroorganizmusok produktivitása fokozható oly módon, hogy a coryneform, glutaminsavat termelő mikroorganizmusokban rezisztenciát alakítunk ki az iturinnal rokon anyagokkal szemben. A találmány értelmében az L-lizin előállítására szolgáló eljárás során az iturinnal rokon anyagokkal szemben ellenálló és L-lizin termelésére képes, glutaimsavtenmelő Corynebacterium glutamicum mikroorganizmust megfelelő táptalajon tenyésztjük, az L-lizint öszszegyűjtjük a tenyészetben, majd onnan kinyerjük. Iturinnal rokon anyagon a továbbiakban valamely, a Bacillus genus mikroorganizmusai által előállított antibiotikumot értünk, amilyen például az iturin A, az iturin C, a mycesubtilin, a bacillomycin, illetve ezek keveréke [Biochim. Biophys. Acta 552, 558-562 (1979), Biochim. Biophys. Acta 684,207-211 (1982)]. A találmány során alkalmazott mutáns törzsek eredeti (kiindulási) baktériumtörzsként bármely, L-lizin előállítására képes, glutaminsav-termelő coryneform mikroorganizmusok közé tartozó baktériumtörzs felhasználható. Előnyösen alkalmazható a Corynebacterium glutamicum H-3149 (FERM BP-158) és a Corynebacterium glutamicum H-4412 (FERM BP-1069). Az iturinnal rokon anyagokkal szemben ellenálló mutáns törzsek oly módon állíthatók elő, hogy a fent említett, eredeti baktériumtörzset 250 pg/ml N-metil- N’-nitro-nitrosó-guanidinnal kezeljük 30 *C hőmérsékleten, 30 percen keresztül, majd izoláljuk a minimális agar-táptalajlemezeken - melyek olyan koncentrá-cióban tartalmazzák az iturinnal rokon anyagokat, hogy az eredeti törzsek nem képesek elszaporodni - kitenyésztő törzseket Ezt követően oly módon állíthatjuk elő a találmány szerinti mutáns törzseket hogy a fentiek szerint nyert, az iturinnal rokon anyagokkal szemben ellenálló mutáns törzseket tenyésztjük, és összehasonlítjuk az egyes törzsek L-lizintermelő képességét, majd ezeket a törzseket választjuk ki a találmány szerinti felhasználás céljára, melyeknek a legmegfelelőbb az L- lizinelőállítási képességük. A fent említett eredeti baktériumtörzseket, valamint a belőlük előállított, az iturinnal rokon anyagokkal szemben ellenálló mutáns törzsek (az iturin A és az iturin C 1:1 tömegarányú keveréke) az alábbi tulajdonságokkal jellemezhetőek: Eredeti törzs: Corynebacterium glutamicum (H-3149) (PERM BP-158), mely S-(2-amino-etil)-ciszteinnel szemben, rifampicinnel szemben, streptomycinnel szemben és 6-aza-uracillal szemben mutat rezisztenciát. Mutáns törzs: Corynebacterium glutamicum (H-4933), mely S-(2-amino-etil)-ciszteinnel szemben, 6- aza-uracillal szemben, rifampicinnel szemben, streptomycinnel szemben, valamint iturinnal rokon anyagokkal szemben ellenálló. Eredeti törzs: Corynebacterium glutamicum (H-4412), (FERM BP-1069), mely S-(2-amino-etil)-ciszteinnel szemben, rifampicinnel szemben, streptomycinnel szemben, 6-aza-uracillal szemben és ß-nafto-kinolinnal szemben mutat rezisztenciát. Mutáns törzs: Corynebacterium glutamicum (H-4934), mely S-(2-amino-etil)-ciszteinnel szemben, rifampicinnel szemben, streptomycinnel szemben, 6-aza-uracillal szemben, ß-nafto-kinolinnal szemben, valamint iturinnal szemben rezisztens. Az ily módon előállított, iturinnal rokon anyagokkal szemben rezisztens, mutáns Corynebacterium glutamicum H-4934 törzset 1988. január 14-én letétbe helyeztük a Fermentációs Kutató Intézet Ipari Tudományos és Technológiai Kirendeltségén (FRI - Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Sciense and Technology, Japan) Japánban, FERM BP-1655 letéti számmal. Az 1. Táblázat a fent említett törzsek szaporodásának mértékét mutatja, minimál agar-táptalajlemezen történő, 24 órás tenyésztés esetén (glükóz: 10 g/1, ammónium-klorid: 1 g/1, kaibamid: 2 g/1, KH2P04: 1 g/1, K2HP04: 3 g/1, MgCl2-2H20: 10 mg/1, ZnS04*2H20: 0,4 g/1, FeS04*7H20: 10 mg/1, MnS04*4H20: 1 mg/1, CuSO5H20: 1 mg/1, (NH4)6Mo7024*4H20: 1 mg/1, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
