203788. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin előállítására fermentálással
1 HU 203 788 B 2 d-biotin: 50 pg/1, agan 20 g/1, pH-7,2). A táptalaj 200 pg/ml iturint tartalmaz (az iturin A és az iturin C, 1:1 tömegarányú keverékét). 1. Táblázat Iturin H-3149 H-4412 H-4933 H-4934 (pg/ml) 0 ++ ++ ++ ++ 200-++ ++ ++ megfelelő szaporodás - nincs szaporodás A találmány céljára előnyös mikroorganizmusok tenyésztése során általában alkalmazhatók azok a táptalajok, amelyeket az aminosavak fermentálással történő előállítása során használnak. Ennek megfe-lelően, bármely szintetikus vagy természetes táptalaj alkalmas erre a célra, amennyiben kellő mennyiségben tartalmazza a következő, a mikroorganizmusok által asszimilálható anyagokat: szénforrások, nitrogénforrások, anorganikus sók, növekedési faktorok, stb. Szénforrásként különböző szacharidok, például glükóz, fruktóz, szacharóz, melasz, keményítő-hidrolizátum, stb., továbbá szerves savak, mint például ecetsav, fumársav, citromsav, stb., valamint alkoholok, például etanol, glicerol, mannóz, stb. használ- hatók. Nitrogénforrásként ammóniát, különböző szervetlen vagy szerves savak ammóniumsóit, például ammónium-kloridot, ammónium-szulfátot, ammónium-acetátot, ammónium-foszfátot, stb., aminokat, egyéb nitrogéntartalmú vegyületeket, peptonokat, húskivonatokat, gabonaszemek áztatófolyadékát, kazein-hidrolizátumot, szójabab-takannánypogácsa hidrolizátumát, különböző fermentációs sejteket és emésztési termékeiket használhatjuk. Anorganikus vegyületekként a kálium-dihidrogénfoszfátot, a dikálium-hidrogén-foszfátot, a magnéziumfoszfátot, a nátrium-kloridot, a ferro-szulfátot, a mangán-szulfátot, a réz-szulfátot, a kalcium-karbonátot, stb. alkalmazhatjuk. A fentieken kívül különböző vitaminokat, például biotint, tiamint, nikotinsavat, ß-alanint, pantoténsavat, stb., aminosavakat, például leucint, valint, aszparaginsavat, glutaminsavat, stb., valamint különböző antibiotikumokat is - például streptomycint, stb. - adhatunk a tenyészethez, szükség esetén. A tenyésztést aerob körülmények között végezzük, például oly módon, hogy az állandó rázás közben történik, vagy úgy, hogy a rázás mellett levegőátfüvatást alkalmazunk folyadékba merített tenyészetben, 20 és 40 *C közötti tenyésztési hőmérsékleten, előnyösen 25-38 *C-on. A táptalaj pH-ja 5 és 9 között, előnyösen 5 a semleges pH közelében tartandó. A táptalaj pH-jának beállítását kálium-karbonát, szervetlen vagy szerves savak, lúgoldatok, ammónia- vagy pH-puffer-oldatok segítségével végezzük. Általában 1-7 napig tartó tenyésztési időszakot kö- 10 vetően a baktériumtenyészetben L-lizin termelődik és halmozódik fel. A tenyésztés végeztével a csapadékokat - például a sejteket - eltávolítjuk a tenyészetből és kinyerjük belőle az L-lizint, ioncsere-kezelés, koncentrálás, kisózás, 15 izoelektoimos pontprecipitáció, stb. egy időben történő alkalmazásával. A továbbiakban a találmány szerinti eljárást példáink segítségével ismertetjük. 20 1. példa Corynebacterium glutamicum H-3149-et, H-4412-t, H-4933-at, vagy H-4934-et oltottunk be az alábbi tenyésztóközeg 20 ml-ét tartalmazó, 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba, majd a tenyésztést rázás közben 25 (220 ford/perc) végeztük, 30 °C hőmérsékleten, 24 órán keresztül. Ezt követően a kapott tenyészet 2 ml-ét olyan, 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba oltottuk be, mely az alábbi, a lizin előállítására szolgáló közeg 20 ml-ét tártál-. mazta, majd rázás közben (220 ford/perc), 30 °C hőmérv 30 sékleten, 72 órán keresztül végeztük a tenyésztést. A tenyésztés befejeztével kolorimetriás eljárás segítségével, savas réz-ninhidrin felhasználásával mértük a keletkezett l-lizin mennyiségét. Megállapítottuk, hogy a tenyészetben a keletkezett L-lizin mennyisége 44 mg/ml, 35 52 mg/ml, 53 mg/ml, illetve 54 mg/ml volt, sósavban kifejezve. Ezt követően a H-4933-as törzs esetében kapott tenyészet 1000 ml-ét centrifugáltuk, majd az így nyert felülúszót kénsav segítségével 1,5 pH-ra állítottuk be, s eztuán Diaion SK-18 típusú (H+ típus, a Mitsubishi Kaséi 40 Corporation terméke), igen savas kationcserélő gyantaoszlopon futtattuk keresztül, az L-lizin adszorbeálása céljából. Ezt követően az oszlopot vízzel átmostuk, majd - az L-lizin frakciók összegyűjtése céljából - 2N vizes ammóniaoldattal eluáltuk. Az így összegyűjtött frakciókat 45 koncentráltuk és ezt a koncentrált oldatot 2,0 pH-ra állítottuk be sósav segítségével, majd hűtés közben etanolt adtunk hozzá, miáltal az oldatból L-lizin-hidroklorid kristályosodott ki. A keletkezett kristály mennyisége 42 g volt 50 Tenyésztőközeg (pH-7,2) L-lizin előállításához használt táptalaj (pH-7,2) Glükóz 40 g/1 „Blackstrap” melasz(glükózban kifejezve) 100 g/1 Pepton 20 g/1 Élesztőkivonat 5 g/1 KH2PO4 0,5 g/1 Karbamid 3g/l Ammónium-szulfát 40 g/1 KH2PO4 14 g/1 MgS<V2H20 0^ g/1 K2HPO4 0,5 g/1 Karbamid 3 g/1 MgS04*2H20 0,5 g/1 Kalcium-karbonát 10 g/1 Biotin 50pg/l 3
