203785. lajstromszámú szabadalom • Biokémiai eljárás Micromonospora fajok transzformálására, és az alkalmas plazmidvektorok előállítására
1 HU 203 785 B 2 ton-rezisztens telepeket izoláltunk, melyek melanint nem termeltek és a Streptomyces transzfrománsokből izolált plazmidok azonosak voltak a pSE8 plazmiddal (restrikciós emésztése, agarózgél-elektroforézis). 3. példa DNS-izolálás Micromonospora purpurea ssp. luridus fajból Micromonospora purpurea ssp. luridus (MNG 00209) tenyészet kacsnyi mennyiségét szilárd táptalajról (0,3% szacharóz, 0,1% KH2PCU, 0,2% NaNOj, 0,05% MgS04*7H20, 0,05% KC1, 0,001% Fe- S04*7H20, 1,5% agar pH-7,0-7,3) 20 ml folyékony táptalajba (1,0% pepton, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% glükóz pH-7,3) oltottuk és szaporítottuk (72 óra, 30- 31 *C, 400 rpm). Ezután a kapott inokulum 2,5 ml-ével oltottunk 50 ml/250-s Erlenmeyer-lombik 0,5% glicinnel és 0,005 M MgCl2-dal kiegészített fenti folyékony tápoldatot. A tenyésztést 30-31 *C-on 400 rpm fordulatszámú körkörös rázógépen 72 órán át végeztük. A micéliumot ezután 0 ’C-on centrifugáltuk (5000 g, 15 perc), mostuk 10,3%-os szacharózoldattal. A sejteket 5 mg/ml végkoncentrációjú lizozimoldattal inkubáltuk 37 ’C-on 1 órán keresztül P pufferben00, majd 1/4 térfogat 0,5 M EDTA pH-8,0 hozzáadása után 1% SDS és 0,5 M NaCIO« végkoncentrációt beállítva további 20 percet inkubáltuk szobahőmérsékleten. Ezután azonos térfogatú 0,3%-os NaCl-oldattal telített fenollal extraháltuk a feltárt sejteket, majd a vizes fázist kloroform: izoamil-alkohol - 24:1 arányú elegyével újra extraháltuk. A DNS kicsapását a vizes oldatból 2-szeres térfogatú absz. etanollal végeztük. A kicsapódott DNS-szálakat üvegbotra tekertük, majd vízben oldottuk. Ezután 20 pg/ml RNáz A-val 37 ’C-on 1 órán át, majd 100 pg/ml Proteináz K és 0,5% SDS jelenlétében 55 ’C-on 1 órán át inkubáltuk. A vizes oldatot a fent említett módon fenoloztuk, majd a vizes fázist kloroformmal extraháltuk. A DNS-t 2-szeres térfogatú absz. etanollal kicsaptuk, üvegbotra tekertük, majd vízben oldottuk. A leírt módszerrel 10 g nedves micéliumból 5-15 mg DNS-t nyertünk. (x) P puffer összetétele: A: 103,0 g szacharóz 0,25 g K2S04 2,02 g MgCl2*6H20 2,0 ml nyomelemoldat (1/2 példában részletezve) 800,0 ml víz B: 3,68gCaCl2*2H20 100 ml víz C: 0,05 gKH2P04 A, B és C oldatokat 0,25 M Tris-HCl autoklávozás után ősszeöntjük. 100 ml víz pH-7,2 4. példa A pSG4 plazmid előállítása 1. A pSE8 plazmid 5,3 kb PstI fragmentumának izolálása és defoszforilálása A pSE8 plazmidot PstI restrikciós enzimmel emésztjük, így két restrikciós fragmentumot kapunk, melyek 3,5 kb és 5,3 kb hosszúak. Az 5,3 kb hosszú fragmentumot 0,8%-os preparatív agarózgélből ismert módszerrel izoláljuk [Maniatis T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. A fragmentum 5’ végein levő foszfátcsoportokat 100 p végtérfogatban, 50 mM Tris- HCl pH-9,1,10 mM MgClj, 0,1 mM ZnCl2,1 mM spermidin összetételű pufferben 0,01 egység/2 pg DNS-borjúbél foszfatáz (CIP) enzimmel távoÜtottukel azért, hogy a későbbi ligáció során megakadályozzuk ezen molekulák köré záródását. A reakciót 15 percig 37 *C-on, majd 15 percig 56 *C-on végeztük. Újabb, az előzővel azonos mennyiségű CIP-enzim hozzáadása után a fenti inkubálást ismételtük. A CEP-enzimet fenollal és kloroformmal történő extrak-cióval távolítottuk el, és a DNS-t Sephadex G50 (0,6*8 cm) oszlopon történő kromatográfiával tisztítottuk. 2. A pSG4 plazmid és a Streptomyces lividans TK64lpSG4 transzformáns elkészítése A 3. példában izolált Micromonospora purpurea ssp. luridus DNS-t PstI restrikciós enzimmel emésztettük, majd az így kapott fragmentumokat összekapcsoltuk a 4/1 példában leírt 5,3 kb hosszú defoszforilált PstI fragmentummal. A kapcsolást az 1/3 példában leírtak alapján T4 DNS-ligázzal végeztük. A ligációs elegyet használtuk. Streptomyces lividans TK64 sejtek transzformációjához.. A transzformációt és protoplaszt regenerációt az 1/2 példában leírtak szerint végeztük. A regenerálódó protoplasztokat 10-16 óra múlva 25 pg/ml tiosztreptonnal és, 100 pg/ml gentamicinnel felülrétegeztük. A kapott Tio® Genta® telepeket mindkét antibiotikumot tartalmazó szelektív táptalajon szaporítottuk, majd plazmidot izoláltunk (pSG4). 5. példa A pSG4 plazmid jellemzése A pSG4 plazmidot PstI restrikciós enzimmel emésztettük. A kapott fragmentumokat (5,3 kb és 4,0 kb hoszszú) 0,8%-os preparatív agarózgélben elválasztottuk és a 4,0 kb hosszú fragmentumot ismert módon [Maniatis T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] izoláltuk. Ezt a fragmentumot a32P ATP-vel E. coli DNS-polimeráz I enzimmel ún. nick transzlációval radioaktívan jeleztük, és hibridizációs kísérlethez használtuk a következőképpen: Micromonospora purpurea DNS-t (3. példa) különböző restrikciós enzimekkel emésztettünk, majd a fragmentumokat 0,7%-os agarózgélben elektroforetizáltuk. Elektroforézis után a DNS- fragmentumokat az agarózgélből nitrocellulóz-filterre vittük és fixáltuk Southern szerint [Southern E.: Methods in Enzymology 68,152-175 (1979)]. A filterekhez a fent leírt radioaktívan jelzett 4,0 kb hosszú fragmentumot hibridizáltuk. A hibridizációt 65 ’C-on 12-16 órán át végeztük a következő oldatban: 5*SSC, SSC-0,15 M NaCl és 0,015 M Trinátrium-citrát oldata (pH-7,0), 0,2% polivinil-pirrolidon, 0,2% BSA (Bovine serum albumin), 0,2% ficoll, 0,1% SDS, 1 mM EDTA. A jelzett DNS-t 104 5 cpm/minta koncentrációban alkalmaztuk, hordozóként 100 pg/ml koncentrációjú ~ 500 bp hosszú E. coli DNS-t használtunk. Hibridizáció után a filtert csökkenő 5
