203785. lajstromszámú szabadalom • Biokémiai eljárás Micromonospora fajok transzformálására, és az alkalmas plazmidvektorok előállítására
1 HU 203 785 B 2 koncentrációjú SSC-oldatban, amely 0,1% SDS-t is tartalmazott, mostuk65 'Con (5*SSC-től0,l*SSC-ig). Afiltert szárítás után autoradiográfiásan vizsgáltuk. Ezek alapján (2. ábra) a pSG4 plazmid egy 4,0 kb hosszú PstI Micromonospora DNS-fragmentumot tartalmaz. Ezek után elvégeztük a pSG4 plazmid restrikciós térképezését (3. ábra). 6. példa A pSGE5 plazmid előállítása 1. A 3,0 kb hosszú PstIpSP64 fragmentum előállítása és defoszforilálása A pSP64 plazmidot a megfelelő pufferben PstI restrikciós enzimmel emésztettük, majd a DNS-t 0,3 M Na-acetát pH-7,0 jelenlétében 3-szoros térfogatú absz. etanollal kicsaptuk. A centrifugált (12 000 rpm, 2 ‘C, 10 perc), majd szárított DNS-csapadékot vízben oldottuk, majd a 4/1 példában leírtak szerint borjúbél foszfatázzal kezeltük. 2. A pSGE5 plazmid előállítása A pSG4 plazmidot PstI restrikciós enzimmel részlegesen emésztettük úgy, hogy 50 |i.l reakcióelegyben 1 jrg pSP64 DNS-t emésztettünk 0,5 egység PstI enzimmel, 37 °C-on, 10 percig, PstI pufferben (Pharmacia-LKB katalógus), majd a kapott lineáris fragmentumokat T4 DNS-ligázzal az 1/3 példában leírtak szerint összekapcsoltuk a fent leírt 3,0 kb hosszú defoszforilált pSP64 plazmid PstI fragmentumával. A ligációs elegyet használtuk E. coli K12 HB101 sejtek transzformálásához, melyet az 1/1 példában leírtak szerint végeztük. 7. példa Az E. colUpSGE5 transzformánsok jellemzése DNS-DNS hibridizációval 1. A 4,0 kb hosszú PstIpSG4 fragmentum előállítása A pSG4 plazmidot PstI enzimmel emésztettük, majd a kapott 5,3 kb és 4,0 kb hosszú fragmentumokat 0,8%os preparatív agarózgélen elválasztottuk, és a 4,0 kb hosszú fragmentumot izoláltuk az agarózgélből. 2 2. DNS-DNS hibridizáció A 6. példában kapott ampicillin-rezisztens telepeket nitro cellulóz-filterre replikáztuk, majd a filtert addig inkubáltuk 37 °C-on, míg a telepek átmérője elérte az 1-2 mm-t, ekkor a filtert áttettük 170 pg/ml kloram- fenikolt tartalmazó L-agar táptalajra és 14-18 órán át inkubáltuk 37 'C-on. A filtert a táptalajról levéve a következő módon kezeltük; 0,5 M NaOH 7 percig, 0,5 M Tris-HCl (pH-7,4) 2*3 percig, 0,5 M Tris-HCl (pH-7,4), 1,5 M NaCl 3 percig. A filtert szobahőmérsékleten szárítottuk, majd a DNS-t 80 °C-on 2 órán át fixáltuk. Az így nyert filterekhez az 5. példában leírtak szerint hibridizáltunk a32p ATP-vel nick transzlációval jelzett a 7/1 példábanleírt 4,0 kb hosszúságú pSG4-PstI fragmentumot. A filterek autoradiográfiás vizsgálata után a radioaktív próbát 65 'C-on 0,l*SSC-t tartalmazó, a hibridiziációhoz használt pufferben 48 órán át inkubálva lemostuk, majd a filterekhez az 5. példában leírtak szerint hibridizáltunk a32P ATP-vel nick transzlációval jelzett pU702 plazmidot. A filtereket autoradiográfiásan vizsgáltuk. Azok a telepek, amelyek a pSGE5 plazmidot tartalmazták, mindkét radioaktív DNS-hez hibridizáltak. Ezek alapján az E. coli/pSGE5 telepeket kiválogattuk, ezekből plazmidokat izoláltunk, majd elkészítettük a pSGE5 plazmid restrikciós térképét (4. ábra). 8. példa Micromonospora purpurea ssp. luridus transzformációja a pSE8 plazmiddal, Micromonospora purpurea ssp. luridus/pSE8 transzformáns előállítása 1. Micromonospora sejtek növesztése protoplasztképzés céljából Micromonospora purpurea ssp. luridus sejteket szilárd (0,5% „tripcasin, 0,5% cellamin, 0,5% boullionpor”, 2,4% buigonyakeményítő, 0,1% glükóz, 0,1% CaC03 és 1,5% agar pH-7,2-7,4) táptalajról 70 ml/500-s Erlenmeyer-lombik folyékony táptalajra (u.e. agar nékül) oltunk. A 400 rpm fordulatszámú körkörös rázógépen 30- 31 'C-on 72 órán át készült sejttenyészetet használjuk kiindulási oltóanyagként protoplasztképzésre alkalmas sejttenyészet elkészítéséhez. Ez a tenyészet 5-10 ml-enként szétosztva -30 ‘C-on tárolható 1-2 évig. 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50 ml 1,0% pepton, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% glükóz pH-7,3,0,7% glicin, 0,005 M MgCf tápoldatba 2,5 ml fagyasztott inokulum sejttenyészetet oltunk, majd 400 rpm, 30-31 'C-on 48-72 órán át végezzük a tenyésztést. „...” - A tripcasin, cellamin, boullionpor a Human Oltóanyagtermelő és Kutató Vállalatnál (Bpest) szerezhetők be. 2. Micromonospora protoplasztok képzése A 8/1 példában leírtak alapján tenyésztett micéliumot 0 'C-on centrifugáljuk (5000 g, 15 perc), majd 10,3%-os szacharózoldattal kétszer mossuk. A sejteket 4 mg/ml lizozim (20 egység/mg) tartalmú P pufferben (3. példában részletezve) szuszpendáltuk (a végtérfogat a tenyésztési térfogat 1/4 része), majd 40-120 percig 37 °C-on inkubáltuk. A micéliumból protoplasztok képződését mikroszkóppal követtük. Amikor a mikroszkópban már micélium nem volt látható, a protoplasztokat P pufferrel kétszeresre hígítottuk és vattán szűrtük. A szűrletből a protoplasztokat centrifugáltuk (8 perc, 2000 g, 20 ‘C), majd P pufferrel mostuk. így 2,5* 108—2,5* 109 protoplasztot kapunk 1 ml tenyésztési térfogatra számítva. 3. Transzformálás Egy-egy transzformációhoz 5‘IC)8—S‘109 protoplasztot centrifugálással összegyűjtünk, majd a felülúszó elöntése után a protoplasztokat a visszamaradó minimális oldatban szuszpendáljuk. Ehhez adjuk a pSE8 plazmid 0,5- 5 |tg-ját, majd 0,5 ml P pufferben oldott 40%-os PEG4000-t. A protoplasztok szuszpendálása után közvetlenül 5 ml P pufferrel hígítottuk az elegyet, majd centrifugáltuk (8 perc, 2000 g). A protoplasztokat P pufferben szuszpendáltuk, majd fedőagarban (1,0% glükóz, 0,8% MgCl2*6H20, 1,0% tripton, 0,5% élesztőkivonat, 0,6 % 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
