203785. lajstromszámú szabadalom • Biokémiai eljárás Micromonospora fajok transzformálására, és az alkalmas plazmidvektorok előállítására
1 HU 203 785 B 2 A találmány tárgya Micromonospora, Streptomyces és adott esetben Escherichia coli gazdasejtek transzformálására alkalmas hibridvektorok, illetve eljárás ezen vektorok előállítására, melyekkel a gazdasejtekbe új genetikai információt lehet bejuttatni. A hibridvektorok előállítási eljárása során- Streptomyces eredetű Micromonosporában is funkcionáló replikációs origóval rendelkező DNS-fragmentumot,- Micromonosporában és Streptomycesben szelektálható fenotípust biztosító génnel rendelkező DNS- fragmentumot, valamint- Escherichia coli replikációs origűval rendelkező DNS- fragmentumot, Escherichia coliban szelektálható fenotípust biztosító génnel rendelkező DNS- fragmentumot és/vagy- Micromonospora eredetű gentamicin-rezisztenciagénnel rendelkező DNS-fragmentumot kapcsolunk össze. A találmány tárgya ezenkívül Micromonospora gazdasejtek transzformálása a fenti hibridvektorokkal és az ezeket a vektorokat tartalmazó Micromonospora törzsek. Mint ismeretes, a sejtek genetikai állományának célzott megváltoztatására a rekombináns DNS-technika alkalmazásával lehetőség nyílik. Ennek egyik módja a következő: 1. Vektormolekula előállítása, amely a) stabilan fennmarad a gazdasejtben, b) szelekciós markerrel rendelkezik, amellyel a vektorjelenléte a sejtben detektálható, c) idegen DNS beépítését lehetővé teszi. 2. Vektormolekula bejuttatása a gazdasejtbe. A prokariota mikroorganizmusokban alkalmazott vektorok egyik típusa a plazmidvektor, melyet úgy állítanak össze, hogy kielégítsék a fent említett követelményeket. Szelekciós markerként prokariotáknál leggyakrabban antibiotikumokkal szembeni-rezisztenciagéneket használnak, amelyek biztosítják a plazmidvektort tartalmazó gazdasejtek elkülönítését. Idegen DNS beépítését a plazmidvektorokban levő restrikciós endonukleáz hasítási helyek teszik lehetővé, amelyek a plazmid replikációját nem érintik. Előnyös, ha a plazmidvektorok legalább két különböző rezisztenciagént tartalmaznak, mivel az egyik segítségével a plazmid jelenléte detektálható a gazdasejtben, a másik rezisztenciagénbe klónozott idegen DNS-molekula jelenlétét pedig ki lehet mutatni a gazdasejt megfelelő antibiotikummal szembeni érzékenységével. A plazmidvektorok tartalmaznak a gazdasejtben való szaporodást biztosító génszakaszt. Számos prokariota mikroorganizmus tartalmaz plazmidot vagy plazmidokat, amelyek replikádét biztosító génszakaszai felhasználhatók plazmidvektorok elkészítéséhez. Az iparban előállított antibiotikumok jelentős részét Streptomyces és Micromonospora fajok termelik. Mindkét genus az Actinomycetales rendbe, a fonalas baktériumok közé tartozik. Számos Streptomyces fajból izoláltak plazmidokat [pl. Bibb et al.: Mol. Gén. Genet. 154, 155-166 (1977), Hayakawa T. et al.: J. Antibiot. 32, 1348-1350 (1979), Bibb et al.: Mol. Gén. Genet. 184, 230-240 (1981)] és ezek segítségével a Streptomyces plazmidvektorok széles skáláját készítették már el [pl. Hopwood et al.: Antibiotic-Producing Streptomyces, Academic Press (1985), Lydiate et al.: Gene 35,223-235 (1985)]. Sőt előállítottak már különböző Streptomyces fajok és E. coli között ún. „ingázó plazmidvektorokat” is (Wohlleben W. et al.: Biological biochemical and biomedical aspects of actinomycetes, Akadémiai Kiadó 99-103 (1985 4358/83 a.sz. magyar szabadalmi bejelentés]. Ezekkel már olyan különböző antibiotikumok bioszintézisében résztvevő génegyütteseket is izoláltak, mint pl. az eritromicin (Baltz R. H. et al.: Biological biochemical and biomedical aspects of actinomycetes, Akadémiai Kiadó 55-67 (1985)], puromicin (Vara J. et al.: Gene. 33, 197-206 (1985)], és az oxitetraciklin (Rhodes et al.: Trans. Biochem. Soc. 12, 586-587 (1984)]. Ezek jelentősége a törzsek antibiotikum termelésének fokozásában óriási. A másik jelentős antibiotikum-termelő ipari mikroorganizmusban, a Micromonospora fajokban plazmidok előfordulása sokkal ritkább. Eddig plazmidot izoláltak M. inyoensis (Parag Y. és Goedeke M. E.: J. Antibiot. 37, 1082-1084 (1984)], M. zionensis (Oshida et al.: Plasmid 16,74-76 (1986)], és M. rosaria (Oshida et al.: Plasmid 16,74-76 (1986)], Monahan et al.: 86th Annual Meeting of the Am. Soc. for Microbiol. (1986)] fajokból, de ezek vektorként való felhasználása egyelőre nem ismert. Ahhoz, hogy egy plazmidmolekula vektorként használható legyen, szükség van hatékony transzformációs módszerre a plazmid gazdasejtbe való bejuttatására. A fonalas baktériumok közül Streptomyces lividans fajra dolgozták ki először a protoplasztképzésen keresztül történő transzformációt (Okanishi et al.: J. Gen. Microbiol. 80, 389-400 (1974)]. Később más Streptomyces fajoknál is alkalmazták a módszert különböző módosításokkal. Néhány Micromonospora fajnál már kidolgozták a protoplasztképzés és regenerálás hatékony módját (Ogawa et al.: J. Antibiot. 36, 184-186 (1983), Ryu et al.: Appl. and Environment. Microbiol. 45, 1854-1858 (1983), Kim et al.: Enzyme Microb. Technoi. 5,273-280 (1983), Kim et al.: Appl. and Environment. Microbiol. 46, 689-693 (1983), de ezeket protoplasztfuzió, illetve protoplaszt-mutagenezis céljából végezték. A találmány célja új hibridvektorok előállítása, illetve transzformációs eljárás kidolgozása, melynek révén lehetővé válik a Micromonospora gazdasejtek transzformálása. A vektorokhoz ezután különböző DNS-fragmentumok kapcsolhatók és transzformációval új genotípusú és új fenotípusú Micromonospora törzsek hozhatók létre. Ennek nagy jelentősége van megváltozott antibiotikum termelőképességű törzsek előállításában. Célunk volt továbbá olyan hibridvektorok előállítása, amelyek alkalmasak Streptomyces és adott esetben Escherichia coli fajok transzformálására is, és így lehetőség nyílik Mikromonospora, Streptomyces és Escherichia coli 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
