203785. lajstromszámú szabadalom • Biokémiai eljárás Micromonospora fajok transzformálására, és az alkalmas plazmidvektorok előállítására
1 HU 203 785 B 2 (továbbiakban E. coli) fajok közötti genetikai információ átvitelére. A találmány tárgya eljárás Micromonospora, Streptomyces és adott esetben E. coli gazdasejtek transzformálására alkalmas hibridvektor előállítására, oly módon, hogy- Streptomyces eredetű Micromonosporában is funkcionáló replikációs origóval rendelkező DNS-fragmentumot,- Micromonosporában és Streptomycesben szelektálható fenotípust biztosító gént tartalmazó DNS-ftagmentumot, valamint- E. coli replikációs origóval rendelkező DNS-fragmentumot, E. coliban szelektálható fenotípust biztosító gént tartalmazó DNS-ffagmentumot és/vagy Micromonospora eredetű gentamicin rezisztenciagénnel rendelkező DNS-fragmentumot kapcsolunk össze. A Micromonosporában és Streptomycesben szelektálható fenotípust biztosító génként előnyösen valamilyen antibiotikum-rezisztenciát, például tiosztreptonrezisztenciát biztosító gént alkalmazhatunk. így tiosztreptont tartalmazó szelektív táptalajon a transzformáns törzsek egyszerűen kiválaszthatók. Hasonlóan megfelel a célnak például a neomicin- vagy apramicin- rezisztenciagén is. A találmány szerint előállított hibridvektorok tartalmaznak Streptomyces eredetű Micromonosporában is funkcionáló replikációs origót. Ez lehetővé teszi a vektorok fennmaradását ezekben a fajokban és egyben mód nyílik genetikai információ átvitelére Micromonospora és Streptomyces fajok között. A replikációs origót legegyszerűbben különböző, ilyen szakaszt tartalmazó plazmid restrikciós enzimmel történő hasításával kaphatjuk meg, előnyösen alkalmazható erre a célra a pU702 plazmid. Az E. coliban szelektálható fenotípust biztosító génként ugyancsak legkézenfekvőbb antibiotikum-rezisztenciagént alkalmazni. így előnyösen az ampicillin vagy más egyéb antibiotikum, például tetraciklin-, klóramfenikol- stb. rezisztenciagén jöhet számításba. Különösen előnyös a kisméretű pSP64 plazmid használata a találmány során, mivel ez az ampicillinrezisztenciagén mellett E. coli replikációs origót tartalmaz. Természetesen E. coli replikációs origót és valamilyen antibiotikum-rezisztenciagént tartalmazó DNS- fragmentumhoz több más, a szakember számára jól ismert módon lehet hozzájutni, például a pBR322 plazmid felhasználásával. Az E. coli eredetű DNS-fragmentumokat is tartalmazó hibridvektorokkal a Micromonospora és Streptomyces fajok mellett E. coli sejtek is transzformálhatóak, ami lehetővé teszi genetikai információ átvitelét a három faj között. A találmány szerint előállított vektorok gentamicinrezisztenciagénnel rendelkező DNS-fragmentumot is tartalmazhatnak, melyet például Micromonospora purpurea ssp. luridus törzsből állíthatunk elő a sejt DNS- ének restrikciós enzimekkel történő emésztésével. Előnyösen alkalmazható a PstI restrikciós enzimmel történő emésztéskor kapott 4 kilobázis (a továbbiakban kb) hosszúságú DNS-fragmentum. Míg az egyik (például tiosztrepton) rezisztenciagén segítségével a plazmidvektort tartalmazó sejtek szelektálhatóak, a másik, például gentamicin- rezisztenciagén lehetővé teszi, hogy az ide beépített idegen DNS-t hordozó rekombináns plazmidokat tartalmazó telepeket kimutassuk. Ezenkívül azt tapasztaltuk, hogy a fenti Micromonospora eredetű 4 kb hosszúságú DNS-fragmentumot tartalmazó hibridvektorokkal a Micromonospora gazdasejtek transzformációjakor megnőtt a transzformációs frekvencia. A találmány szerinti eljárás során a fent említett DNS-fragmentumokat önmagában ismert módon T4 DNS-ligázzal kapcsoljuk össze. A találmány egyik előnyös megvalósítása során a pSE8 plazmidvektort állítottuk elő, melynek restrikciós térképe az 1. ábrán látható. Az előállításhoz pSP64 plazmidot (Promega Biotec) BamHI restrikciós enzimmel linearizáltunk és ehhez kapcsoltuk a pU702 plazmid (ATCC 35287) BglII restrikciós enzimmel linearizált DNS-ét. A pSP64 plazmid E. coli replikációs origót, SP6 promotert és ampicillin-rezisztenciagént, a pU702 plazmid Streptomyces replikációs origót és tiosztrepton-rezisztenciagént tartalmaz. Az így kapott vektorral E. coli K12 HB101 sejteket transzformáltunk, majd az Amp® (ampicillin-rezisztens) telepekből plazmidot izoláltunk és a megfelelő méretűekkel Streptomyces lividans TK64 sejteket transzformáltunk. Mivel a pU702 plazmid BglII hasítási helye a tirozinázgénen van, a két plazmid összekapcsolódásával keletkező pSE8 hibridvektort tartalmazó telepek tiosztrepton-rezisztensek és nem termelnek melanint, ami alapján kiválaszthatóak. A fenti két plazmidból kiindulva más, például SacI, PstI, KpnI restrikciós enzimekkel történő linearizálás, majd a DNS-fragmentumok összekapcsolása után a pSE8-hoz hasonló E. coli-Streptomyces- Micromonospora ingázó vektorokat állíthatunk elő. A 3. ábra a pSG4 vektor rstrikciós térképét ábrázolja, amelynek előállításához először a pSE8 vektort PstI restrikciós enzimmel emésztettük. így kaptunk egy rövidebb és egy hosszabb, 5,3 kb hosszúságú DNS-fragmentumot. Micromonospora purpurea ssp. luridus törzsből, mely a Magyar Nemzeti Törzsgyűjteményben MNG 00209 számon van letétbe helyezve, DNS-t izoláltunk és ezt PstI restrikciós enzimmel emésztettük. Az így kapott DNS-fragmentumokat - melyek között volt egy 4 kb hosszúságú fragmentum is - összekapcsoltuk a fenti 5,3 kb hosszúságú PstI fragmentummal, majd a vektorokkal Streptomyces lividans TK64 sejteket transzformáltunk. A 4 kb hosszúságú Micromonospora eredetű DNS-fragmentumot is tartalmazó hibridvektorok a tiosztrepton mellett gentamicin-rezisztenciát is biztosítottak az őket tartalmazó sejteknek, így ezekből plazmidizolálással a hibridvektorokat kinyertük. A pSGE5 plazmidot (4. ábra) a pSG4 és a pSP64 plazmidokból állítottuk elő. A pSG4 plazmidot PstI restrikciós enzimmel történő részleges emésztéssel linearizáltuk és T4 DNS-ligáz jelenlétében összekapcsoltuk a pSP64 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
