203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 kát gyűjtünk. Mindegyik frakció aktivitását a Cserenkov-sugárzás mérésével határozzuk meg és ezzel azonosítjuk a ffagmenteket. A kis DNS-fragmentet tartalmazó kívánt frakciókat egyesítjük, a DNS-t 2 térfogat etanollal kicsapjuk és centrifugálás után ismét 20 pl 10 mM Tris*HCl (pH 74), 04 mM EDTA oldatban oldjuk. A 32P-jelzett EcoRI-Bgin DNS-fragmentet 0,2 egység Taql- gyei (Biolabs) 50 pl térfogatban 10 percen át 37 *C- on részlegesen hasítjuk. A reakcióelegy összetételét 0,2% SDS-re, 10% glicerinre, 10 mmól EDTA-ra, 0,05% brómfenol-kékre állítjuk és a DNS-fragmenteket 6%-os poliakrilamidgélen Tris-borát-EDTA-pufferben (22) szétválasztjuk. Az autoradiogrammon azonosítjuk a kívánt EcoRI-Taql fragmentet (a legnagyobb részfragment) tartalmazó sávot. Ezt a fragmentet (L, lásd 5. ábra) a gélből extraháljuk és tisztítjuk (23) és 10 pl 10 mM Tris*HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA oldatban oldjuk. Akceptor-plazmidként Clal-gyel és EcoRI-gyel hasított pBR322-t alkalmazunk: 2 pg pBR322-t 4 egység Clal-gyel (Biolabs) 20 pl reakciótérfogatban 60 percen át 37 *C-on emésztünk. A fehérjét fenollal extraháljuk, majd a DNS-t 2 térfogat etanollal -80 'C-on 10 perc alatt kicsapjuk. A DNS-t centrifugálással gyűjtjük, majd 10 egység EcoRI-gyel (Biolabs) 30 percen keresztül 37 'C-on 20 pl reakciótérfogatban emésztjük. Utána az oldatot 2 térfogat 0,1 M Tris*HCl-lel (pH 8,7) elegyítjük és 1 egység boíjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37 'C-on inkubáljuk. A foszfatázt ezután 65 'C-on 60 perces inkubálással inaktiváljuk. 100 ng akceptor-plazmidot 5 pl L-DNS-fragmenttel 15 pl reakciótérfogatban 10 mM MgCk, 20 mM Tris*HCl (pH 7,8), 10 mM DTT, 0,5 mM ATP összetételű oldatban reakciótérfogat pl-enként 30 egység T« DNS- ligázzal (Biolabs) 2 órán át inkubálunk. Ebből az oldatból 5 pl-t adunk egy olyan 200 pl végtérfogatú elegyhez, amely 150 pl kalcium-kloriddal kezelt E.coli HB101 sejtet (6) tartalmaz 10 mM MgCh, 10 mM CaCh és 10 mM Tris«HCl (pH 74) összetételű oldatban. Az elegyet 20 percen át jégben hűtjük, 1 percre 42 *C-ra melegítjük és 10 percen át 20 *C-on inkubáljuk. 1 ml Trypton-médiumot [a Trypton-médium 10 g Bacto-Tryptont (Difco); 1 g élesztőkivonatot (Difco); 1 g glükózt; 8 g NaCl-ot és 294 mg CaClj*2HjO-t tartalmaz 1 1 desztillált vízben] adunk hozzá és az elegyet 30 percen át 37 'C-on rázás közben, 300 f/p, inkubáljuk. Az elegyet két, 50 pg/ml ampicillinnel (Sigma) kiegészített agarlemezre (McConkey agar, Difco; 0,6 ml/lap) visszük fel. A lemezeket 12-17 órán át 37 'C-on inkubáljuk. 10 különböző kolónia plazmid-DNS-ét a következőképpen izoláljuk: A kolóniákat 25 ml-es Erlenmeyerlombikokban lévő, 50 pg/ml ampicillinnel kiegészített 10-10 ml Trypton táptalajba oltjuk. A kultúrákat 15-18 órán át 37 ‘C-on és 300 f/p-cel rázzuk. A sejteket centrifugálással (Sorval, HS-4 rotor, 10 perc, 4 000 f/p-en, 4 'C) gyűjtjük össze. Kb. 0,1 g sejtet kapunk és ezt 1 ml 50 mM Tris*HCl-ben (pH 8,0) újraszuszpendáljuk. 0,25 ml lizozimoldatot [10 mg/ml 50 mM Tris*HCl-ben (pH 8,0); a lizozimot a Sigma hozza forgalomba] adunk hozzá és 0 'C-on való 10 perces inkubálás után 0,15 ml 0,5 M EDTA-t (pH 7,5) adunk hozzá. 0 'C-on való további 10 perces inkubálás után 60 pl 2%-os Triton X-100-at (Merck) adunk hozzá. 30 perces 0'C-on való állás után a mintát 30 percen át 4 'C-on 15 000 f/p-en Sorval SA-600 rotorban centrifugáljuk. A felülúszót fenollal (telített TNE-vel) fehérjementesítjük. A fázisokat 10 percen át 5 000 f/p-en 4 *C-on végzett centrifugálással (Sorval HB-4 rotor) választjuk szét. A felső fázist kétszer 1 térfogat kloroformmal extraháljuk. 25 pg/ml végkoncentráció eléréséig pancreas RN-ázt (Sigma: 10 mg/ml TNE-ben 10 percig 85 'C-on előmelegítve) adunk hozzá és az elegyet 40 percen át 37 'C-on inkubáljuk. Az oldatot utána 1 M NaCl-ra és 10% polietilénglikol 6000-re (Fluka, 20 percig 120 'C-on autoklávba kezelt) állítjuk és 2 órán át -10 'C-on inkubáljuk. A csapadékot Sorval HB-4 rotorban (20 perc, 10 000 f/p, 0 'C) gyűjtjük és újból 100 pl TNE-ben oldjuk. A DNS-oldatot 1 térfogat fenollal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat etanollal 10 percen át -80 'C-on kicsapjuk. A csapadékot Eppendorf-centrifugában történő centrifugálással gyűjtjük és a DNS-t 20 pl 10 mM Tris*HCl (pH 7,5) és 0,5 mM EDTA összetételű oldatban ismét oldjuk. 10 ml kultúrából 8-10 pg plazmid-DNS-t kapunk. A plazmid-DNS-eket a következő restrikciós enzi-. mekkel való emésztéssel analizáljuk: 0^-04 Hg plazmid-DNS-t Hpal-gyel (Biolabs), valamint Hpal-gyel (Biolabs) és EcoRI-gyel (Biolabs) Clal-gyel (Biolabs) az enzimelőállító adatainak megfelelő standard-előírás szerint hasítunk. A DNS-eket 1%os agarózgélen 40 mM Tris*acetát (pH 7,8), 1 mM EDTA és 0,5 pg/ml etidium-bromid összetételű oldatban frakcionáljuk. A kívánt plazmidok egy Hpal- helyet tartalmaznak és a háromszori emésztés után a nagy DNS- fragment mellett 2 kisebb fragmentet eredményeznek, amelyek nagyobbak, mint a pBR322 kis Eco- Rl-Clal-ffagmentje. Ezeknek a plazmidoknak az egyikét pl59-cel jelöljük (lásd 5. ábra). B. A pHRH45 piamid előállítása 2 pg pl59-DNS-t 10 egység EcoRI-gyel (Biolabs) 30 percen át 37 'C-on emésztünk. A DNS-t fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és centrifugálás után 10 pl 10 mM Tris*HCl (pH 74), 0,5 mM EDTA oldatban oldjuk. Az EcoRI-gyel emésztett DNS-t ezután 15 percen át 12 'C-on 5 egység DNS-polimerázzal (Klenow-fragment) (Boehringer) kezeljük 10 mM MgCU, 10 mM ß-merkapto-etanol, 50 mM NaCl, 0,1 mM dATP (P&L Biochemicals) 0,1 mM dTTP (P&L Biochemicals) összetételű oldatban. A polimerázt 5 perces 85 'C-on való inkubálással inaktiváljuk. A reakcióelegyet 20 mmól Tris*HCl (pH 7,8), 10 mM MgCU, 10 mM DTT, 04 mM ATP (Sigma) összetételű oldatban tízszeresre hígítjuk és reakcióelegy pl-enként 30 egység T« DNS-ligázzal 1 órán át 15 'C-on inkubáljuk. 50 ng DNS-sel E.coli-1 transzformálunk (a fenti módon) és 50 pg/ml ampicillinnel kiegészített McConkeyagarlemezeken szélesztjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 27
