203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 10 különböző kolóniából a fenti módon izoláljuk a plazmid-DNS-t. A plazmid-DNS-eket EcoRI-gyel való emésztéssel analizáljuk. A kívánt plazmidok EcoRI-rezisztensek. Az analízist a fent leírt módon végezzük. A kívánt plazmid egyikét HRil45-tel jelöljük (5. ábra). C. A pHRH48 plazmid előállítása 2 pg pHRil45-DNS-t 5 egység Clal-gyel (Boehringer) 60 percen át 37 'C-on kezelünk, majd fenolos extrakcióval fehérjementesítünk. A DNS-t etanollal kicsapjuk, és utána 20 pl 10 mM Tris*HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA oldatban oldjuk. A ragadós végeket a fenti módon DNS polimeráz I (Klenow- fragment)-tel töltjük fel azzal a változtatással, hogy dATP és dTTP helyett dCTP-t (P&L Biochemicals) és dGTP-t (P&L Biochemicals) alkalmazunk. A polimerázt 5 perces melegítéssel 85 'C-on inaktiváljuk. A reakcióelegyet 2 térfogat 0,1 M Tris*HCllel (pH 8,7) elegyítjük és 0,5 egység borjú-foszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37 'C-on inkubáljuk. A reakcióelegyet fenolos extrakcióval fehéijementesítjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 8 pl 10 mM Tris*HCl (pH 7^), 04 mM EDTA oldatban oldjuk. A kémiailag szintetizált 5 ’-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3 ’képletű linker (kapcsoló)-DNS-t az 5’-végen foszforiláljuk oly módon, hogy 8 pmól linkért 5 pCi fy-32P]ATP-vel (5500 Ci- mmól1 Amersham) inkubálunk 0,1 mM ATP- vel (Sigma), 50 mM Tris*HCl-lel (pH 94), 10 mM MgCU-vel, 5 mM DTT-vel és 2 egység T4-polinukleotidkinázzal (P&L Biochemicals) 8 pl reakciótérfogatban 30 percen át 37 'C-on. A reakciót -80 'C-on való befagyasztással állítjuk le. A radioaktív jelzett linkért utána 1 pg Clal-gyel és foszfatázzal kezeljük és pHRil45-DNS-sel (lásd fenti) kapcsoljuk 20 pl reakciótérfogatban, amely 04 mM rATP-t (Sigma), 10 mM DTT-t (Calbiochem), 20 mM Tris*HCl-t (pH 7,8), 1 mM MgCh-t és 800 egység T4 DNS-ligázt (Biolabs) tartalmaz. Az inkubálás 15 'C-on 2 órán át történik. A ligázt 10 perces inkubálással 85 °C-on inaktiváljuk. Utána 2 térfogat vizet adunk hozzá, a konyhasó-koncentrációt 10 mM-ra állítjuk és 20 egység KpnI-et (Biolabs) adunk hozzá 30 perc alatt 37 'C-on. Fenolos és kloroformos extrakció után az elegyet 0,9%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen (Biorad) 40 mM Tris*acetát (pH 7,8), 1 mM EDTA és 0,5 pg/ml etidium-bromid összetételű pufferben frakcionáljuk. Az UV-sugárzásban látható, az azonos nagyságú marker-(jelz<5)-DNS-sel megegyező mozgékonyságú sávokat szikével kivágjuk. A géldarabokat 65 'C-on 5 perc alatt megolvasztjuk, majd 37 'C-ra hűtjük. Kb. 20 pl térfogatú oldatot kapunk. Az oldatból 5 pl-t kiveszünk és 400 egység T4-ligázzal (Biolabs) inkubáljuk 10 pl reakciótérfogatban, amely 0,5 mM ATP-t, 10 mM DTT-1, 10 mM MgCh-t, 20 mM Tris*HCl-t (pH 7,8) tartalmaz, 12 órán át 15 *C-on. 100 mM Tris*HCl-t (pH 74), 100 mM CaCL-t és 100 mM MgCh-t tartalmazó oldatból 1/10 térfogatnyit ligázelegyhez (15 'C- on megszilárdul) adjuk és 65 *C-on 5 percig inkubáljuk. Utána az oldatot a fenti módon kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjához alkalmazzuk. 50 pg/mg ampicillinnel kiegészített McConkey-agarlemezeken szélesztjük. 10 különböző kolónia plazmid-DNS-ét a fenti módon izoláljuk és a DNS-t a következő restrikciós enzimekkel analizáljuk; 0,5-04 pg plazmid-DNS-t egymás után KpnI-gyel (Biolabs) Ncol-gyel (Biolabs) és Eco- RI-gyel (Biolabs) hasítunk az enzim- előállító előírásai szerint. A hasítási termékeket 1% agarózgélen 40 mM Tris*acetát (pH 7,8), 1 mM EDTA, 0,5 pg/ml etidiumbromid összetételű oldatban frakcionáljuk. A kívánt módon mindegyik plazmid mutat egy-egy a fenti enzimekhez tartozó hasítási helyet. Az egyik plazmidot HRÍ148 jelöléssel látjuk el. A HRH48 plazmid triptofán-promoter-operátort és riboszomális kötőhelyet tartalmaz. Az eglin-C-gént akár csak más heterológ géneket közvetlenül a plazmidban egyszer előforduló Eco- RI-, Ncol-, KpnI-helyekre kapcsolhatjuk. Ez a szerkesztés lehetővé teszi a heterológ gének közvetlen összekapcsolását és kifejeződését anélkül, hogy az iniciációhoz és a transzlációhoz szükséges ATG jelenléte a megfelelő génen szükséges lenne. Ezt Ncol-gyel való hasítással és a ragadós végek DNS-polimeráz I-gyel való feltöltésével a leírt módon, vagy KpnI-gyel történő hasítással és a ragadós végek Srnukleázzal való eltávolításával könnyen elérhetjük. A HRÍ148 plazmid így egy széles körben alkalmazható expressziós plazmid. D. A linearizált pHRil48IEcoRIIBamHI vektor előállítása 5 pg pHRil48 plazmid-DNS-t a 15. a) példában leírt módon EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztünk. A kimetszett pHRil48/EcoRI/BamHI vektort sűrűséggradiens- centrifugálással [vö. 15. a) példa] izoláljuk. b) Az Fi(O-Fi-EcoRUBamHUDNS (6. ábra) előállítása 5 pg pML141 plazmid-DNS-t a 11. a) és 13. a) példákban leírt módon EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztünk. Fenol/klorofoimos extrakció és alkoholos kicsapás után az Fi(C)-IVEco- RI/BamHLDNS** 1% alacsony olvadáspontú agarózon (Biorad) végzett gélelektroforézissel [13. a) példa] a plazmidtól (pBR322/EcoRI/BamHI) elválasztjuk és EtBr- dal láthatóvá tesszük. Utána az Fi(C)-F2-DNS (-236 bázispár) sávját tartalmazó géldarabot kivágjuk és 65 ‘C-on 10 perc alatt elfolyósítjuk. c) A pHRH48IEcoRl/BamHI vektor-DNS összekapcsolása az Fi(C)-Fi-DNS-sellEcoRIIBamHI és a pML147 plazmid (6. ábra) előállítása 100 ng (kb. 100 nmól vég) pHRil48/EcoRI/BamHI plazmid-DNS-t és 28 ng (713 nmól vég) Fi(C)-F2-Eco- RI/BamHI/DNS-t [10 pl 18. b) példában kapott folyékony gélben oldva] 37 'C-on 20 pl térfogatban egymással összekeverünk és a 13. c) példában leírt módon T4 DNS-ligázzal 15 'C-on 16 órán át kezelünk. Ily módon az elegyben az eglin-C-gént (Fi(C)-F2-DNS) tartalmazó pML147 expressziós plazmid képződik. d) Az E.coli HB101 transzformációja a pML147 plazmiddal 10 pl pML147 plazmidot tartalmazó elegyet [18. c) példa] 10 perc alatt 65 'C-on elfolyósítunk és kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjához 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 28
