203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 leírt módon oldjuk és EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztjük. Az oldatot TNE-re állítjuk és 30 ng (-50 nmól vég) pBR322/EcoRI/BamHI vektor-DNS-t [vő. 15. a) példa] adunk hozzá. Az oldatot ismét fenol/kloroform eleggyel extraháljuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A kicsapott DNS-keveréket a 13. c) példában megadott módon T< DNS- ligázzal (Biolabs) kezeljük. Ezen a módon az oldatban olyan rekombináns plazmidok képződnek, amelyek beillesztett Fj(C)-F2-DNS-t (eglin-C-gén) tartalmaznak. d) E.coli HB101 transzformációja pML141 plazmiddal A kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációja a 11. d) példában leírt módon történik. A 15. c) példában kapott reakcióelegyból 10 pl-t alkalmazunk. 2586 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk. e) Az Fj(C)-F2-DNS-t tartalmazó kolóniák „screen"-elése A 11. e) példában leírt módon megvizsgáljuk 18 transzformált kolónia [15. d) példa] Fi(C)-F2-DNS-tartalmát. Radioaktív próbaként az 5. és 6. példákban leírt oligonukleotidok keverékét alkalmazzuk. Az autoradiogrammon 13 pozitív kolóniát kapunk, ezek közül négy a pML141, pML143, pML144, pML145 jelzést kapja. Analóg módon a pML87 (C’), Ul. pML87 (C”) plazmidot Hpall és EcoRI restrikciós endonukleázzal hasítjuk, a kapott FKO-DNS/EcoRI/Hpall-t, ül. Fi(C”)DNS/EcoRI/Hpaü-t Fí-DNS/Bamffl/HpalI-vel összekapcsoljuk és a képződött Fi(C’)- F2-DNS/EcoRI/Bam- Hl-t, ill. Fi(C”)-F2-DNS/EcoRI/BamHI-t a linearizált pBR322/EcoRI/BamHI vektorral összekapcsoljuk. A kapott plazmidokat, amelyek az Fi(C’)-F2-DNS-t, ül. Fi(C”)-F2-DNS-t tartalmazzák, a kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjához alkalmazzuk. A transzformált sejtek tenyésztése 850, ill. 585 ampicillin-rezisztens kolóniát eredményez. A transzformált kolóniákat 91/37 komplementer (C) oligonukleotiddal vizsgáljuk F,(C’)-F2-DNS, iü. FKOFj-DNS előfordulására. 18 Fi(C’)-F2-DNS-t tartalmazó, és 31 Fi(C”)F2-DNS-t tartalmazó kolóniát azonosítunk. Mindig kiválasztunk egy kolóniát és a pML141(C’), ül. pML141(C”) jelzést kapja. 16. példa Az F\(B)-Fi-DNS-t tartalmazó pML160 plazmid előállítása a) Az Fj(B)-DNS/EcoRI/HpaII előállítása Az Fi(C)-DNS-EcoRI/HpaII-re leírttal [15. b) I. példa] analóg módon 10 |ig pML90 plazmid-DNS-t először Hpaü-vel, majd EcoRI-gyel hasítunk. A fiagmentkeveiéket a leírt módon PAGE-vel tisztítjuk. b) Az Fi(B)-DNS összekapcsolása az Fi-DNS-sel és rekombináns plazmid készítése A 10 pg Fi(B)-DNS/EcoRI/HpaII-ből (lásd fenti) és 9 pg F2-DNS/BamHI/Hpan-ből [15. b) H. példa] kiinduló kapcsolás 15. c) példában leírt módon történik. A képződött Fi(B)-F2-DNS/EcoRI/BamHI-t a leírt módon 30 pg pBR322/EcoRI/BamHI vektor-DNS-sel [vö. 15. a) példa] kapcsoljuk. A képződött rekombináns plazmidot tartalmazó oldatot kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjához alkalmazzuk. 15 transzformált kiónt vizsgálunk meg Fi(B)-F2-DNS-tartalomra a 11. e) példában leírt módon. Radioaktív próbaként ismét az 5. és 6. példákban leírt oligonukleotidok keverékét használjuk. Az autoradiogrammon 6 pozitív kolóniát kapunk, közülük egy a pML 160 jelzést kapja. 17. példa A pML141 és pML160 klánok jellemzése 10—10 pg pML141 és pML160 plazmid-DNS-t mindegyik esetben EcoRI, ül. BamHI restrikciós endonukleázzal emésztünk [vö. 11. a), ül. 13. a) példa]. A pML141 és pML160 karakterizálása a 14. példában már leírt módon történik. Az Fi(C)-F2-DNS-re és Fi(B)-F2-DNS-re meghatározott nukleotidszekvenciák azonosak a fenti szintetikus eglin-C- és eglin-B-gén szekvenciákkal. 18. példa A pML147 expressziós plazmid előállítása a) A trp-promoter-operátor-t tartalmazó linearizált pHRil48/EcoRl/BamHI vektor készítése (5. ábra és 6. ábra) A. A pl 59 plazmid készítése 10 pg pBRHtq, (21) plazmidot 50 egység EcoRI-gyel (Biolabs) 60 percen át 37 "C-on hasítunk, és az emésztett keveréket fenolos extrakció után szaharóz-sűrűséggradiensen - (5-23%) 50 mM Tris*HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA- TST 41 rotorban (Kontron AG) frakcionáljuk. A centrifugálás 40 000 f/p-en és 15 'C-on 14 órán át tart. ISCO-gradiensgyűjtővel 1 ml/perc áramlási sebességgel 0,3 ml-es frakciókat szedünk. A kisebb fragmentet tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldatot TNE-re áüítjuk és 2 térfogat etanoüal -20 "C-on kicsapjuk. A DNS-t centrifugálás után Eppendorf-centrifugában 100 pl 10 mM Tris*HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA-ban oldjuk. Ebből a DNS-fragmentből 5 pg-ot 5 egység Bglü-vel (Biolabs) hasítunk 60 percen át 37 "C-on. A reakcióelegyet fenollal és kloroformmal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat etanollal -80 "C-on 10 percen át inkubáljuk, a DNS-t centrifiigálással gyűjtjük és újra 50 pl 50 mM Tris*HCl (pH 8,0-ban) oldjuk. Ebből az oldatból kiveszünk 2 pl-t (0,2 pg DNS) és 50 mM Tris*HCl-ben (pH 8,0) 10 ng/pg DNS-koncentráció mellett 1 egység boíjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) inkubáljuk 30 percen át 37 'C-on. Az oldat 60 percen át 65 'C-ra való melegítésével az enzimet inaktiváljuk. Kiveszünk 0,04 pg DNS-t és az 5’véget 10 pCi [y-3JP]ATP-vel (>5000 Ci/mmól, Amersham) és 5 egység T4-polinukleotid-kinázzál (P-L Biochemicals) 20 pl reakciótérfogatban 50 mM Tris*HCl (pH 9,5), 10 mM MgCb, 5 mM DTT összetételű oldatban 30 percen át 37 “C-on inkubálva jelölünk. A radioaktív próbát a nem jelölt próbával (lásd fent) keverjük és a DNS-fragmenteket 5-23% szacharóz-sűrűséggradiensen - 50 mM Tris*HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA - TST 60 rotorban frakcionáijuk. A centrifugálást 60 000 f/p-ben 15 'C-on 5 órán át végezzük. 0,2 ml-es frakció5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 26
