203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 szerves fázist szárítjuk, bepároljuk és hexánba csepegtetjük. A csapadékot lesztűjük, 50 ml 7:3 arányú diklór-metán/tnetanol elegyben oldjuk és 0 'C-on 3,8 g p-toluolszulfonsav-monohidrát 75 ml diklór-metán/metanol 7:3 arányú elegyével készített oldatával elegyítjük. 2 óra elteltével a reakcióelegyet diklór-metánnal hígítjuk és hideg nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal kirázzuk. A szerves fázist bepároljuk és hexánnal elegyítjük. A kivált 2- ciano-etil-2-klór-fenil-timidin-3 ’-foszfátot kovasavgélen diklór-metán/metanollal (96:4) kromatografáljuk. VRK: Rf 0,45 diklór-metán/metanolban (9:1). y) Kondenzáció 5’-(4-metoxi-tritil)-3’-ciano-etilbisz-timidin-dinukleotiddá: 2,2 g 2-ciano-etil-2-klór-fenil-timidin-3’-foszfátot kétszeri absz. piridines bepárlással vízmentesítünk, 20 ml absz. tetrahidrofuránban oldunk és a 2-klór-fenil-lbenztriazolil-5 ’ -(4-metoxi-tritil)-timidin-3 ’ -foszfát-oldatmaradék harmadához adunk. A reakcióelegyhez 18 óra elteltével szobahőmérsékleten jeges hűtés közben 10 ml vizet és 200 ml etil-acetátot adunk. A szerves fázist többször mossuk nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és vízzel, nátrium-szulfáton szárítjuk és kis térfogatra bepároljuk. A foszfátrészben és az 5’-, ill. 3’-végen védett dinukleotidot 1:1 arányú éter/hexán elegybe való becsepegtetéssel csapjuk ki. VRK: Rf 0,48 diklór-metán/metanolban (9:1). b) A írinukleotid szintézise A fenti teljesen védett dinukleotid 1,17 g-ját (1 mmól) 30 m 7:3 arányú diklór-metán/metanol elegyben oldjuk és jeges hűtés közben 1,9 g p-toluolszulfonsavmonohidrát 20 ml 7:3 arányú diklór-metán/metanollal készített oldatával elegyítjük. 2 óra elteltével jéghideg nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot adunk hozzá és diklór-metánnal extraháljuk. A szerves fázist szárítjuk, bepároljuk és hexánban csepegtetjük. A kivált, nyers, szabad, 5’-hidroxi-csoportot tartalmazó dinukleotidot kovasavgélen diklór-metán/2-8% metanol gradienssel kromatografáljuk. VRK: Rf 0,33 diklór-metán/metanolban (9:1). 850 mg 5’-hidroxi-dinukleotidot és 1,06 g trietil-ammónium-2-klór-fenil-5 ’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3 ’-foszfátot (vö. a/a szakasz) kétszer piridinnel bepárlunk, utána 10 ml absz. piridinben oldunk és 560 mg mezitilénszulfonil-3-nitro-l,2,4-triazoliddal (MSNT) elegyítünk. Két óra eltelte után 2 ml jéghideg vizet adunk hozzá és további egy óra múlva diklór-metánnal extraháljuk. A szerves fázist telített nátrium-hidrogén- karbonáttal és vízzel mossuk, szárítjuk, bepároljuk és éterrel elegyítjük. A kivált trinukleotidot kovasavgéles kromatográfiával tisztítjuk. Rf 0,45 diklór-metán/metanolban (9:1). 4 4. példa A 3. példával analóg módon előállítjuk a következő (XIII) általános képletű, rövidítve B‘B2B3 védett trinukleotidokat. AB1, B2, B3 nukleozidokra a következő rövidítéseket használjuk. A - N-benzoil-dezoxiadenozin C - N-benzoil-dezoxicitidin G - N-benzoil-dezoxiguanozin T - timidin Vegyület Rf Vegyület Rf TTT 0,45 ATG 0,48 TTC 0,55 ACT 0,53 TCT 0,46 ACC 0,48 TAC 0,56 AAT 0,49 TAA 0,53 AAC 0,46 TAG 0,60 AAA 0,51 TGT 0,42 AGT 0,45 TGG 0,43 AGA 0,49 CTG 0,46 GTT 0,45 CCT 0,45 GCT 0,55 CCG 0,47 GCA 0,49 CAT 0,55 GCG 0,48 CCA 0,52 GAT 0,44 CAG 0,44 GAC 0,48 CGT 0,49 GAA 0,50 GGA 0,44 GGT 0,46 ** Vékonyréteg-kromatogramm kovasavgélen diklór-metán/metanolban (9:1). 5. példa A komplementer DNS-szál (172/61 komplementer) 172. számú bázisától a 232. számú bázisáig terjedő 61 bázishosszúságú DNS- fragment szintézise a) A írinukleotid 2-ciano-etil-védőcsoportjának lehasítása A 3. vagy 4. példa szerint előállított trinukleotidból 15 pmól-t a nedvesség kizárása mellett 60 pl 1:1:1 arányú piridin/acetonitril/trietil-amin elegyben oldunk. 1 óra eltelte után szobahőmérsékleten 0,7 ml peroxidmentes étert csepegtetünk hozzá és a csapadékot lecentrifugáljuk. A nyers trietil-ammónium-sót 50 pl piridinben oldjuk, 0,5 ml éterrel még egyszer kicsapjuk, lecentrifugáljuk és 15 órán át nagyvákuumban szárítjuk. b) A részlegesen védett trinukleotidok kapcsolása a polisztirolgyantához kötött oligonukleotidlánccal Az összes műveletet a nedvesség kizárása mellett egy 280 pl űrtartalmú és mikroprocesszorral vezérelt oldószer- és reagensadagolású reakcióedényben végezzük. A reakcióedénybe előre beteszünk 17,6 mg (1,5 pmól) citidin-polisztirolgyantát (1. példa) és a következő műveleteknek vetjük alá. 1. Metilén-klorid, 2 ml/perc, 5 perc. 2. Metilén-klorid/izopropanol (85:15), 2 ml/perc, 2 perc. 3. Cink-bromid 1M és 1,2,4-triazol 0,02 M metilénklorid/izopropanolban (7:3), 1 ml/perc, 2-3,5 perc. 4. Metilén-klorid/izopropanol (85:15), 2 ml/perc, 3 perc. 5. Trietil-ammónium-acetát 0,5 M DMF-ben, 2 ml/perc, 10 perc. 6. Molekulaszitán szárított piridin, 2 ml/perc, 5 perc. 7. Tetrahidrofurán (peroxidmentes, molekulaszitán szárított) 2 ml/perc, 5 perc. 8. Nitrogénáram, 10 perc. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 20
