203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására

1

HU 203 784 B

2

9. 160 pl piridinben oldott 15 pmól AAA trinukleotid [trimetil-ammónium-só az a) szakaszból] és

13,3 mg (45 pmól) mezitilén-szulfonil-3-nitro-1,2,4-triazolid (MSNT) injektálása.

10. 40 “C, 30 perc. 5

11. Piridin, 2 ml/perc, 5 perc.

12. 5% acetanhidrid és 2,5% 4-dimetil-amino-piridin/piridinben, 2 ml/perc, 5 perc.

13. Piridin, 2 ml/perc, 5 perc.

14. Piridin/izopropanol (1:1), 2 ml/perc, 3 perc.

Mind a 14 műveletet 19-szer ismételjük, mimellett a

9. műveletnél AAA helyett mindig a trietil-ammóniumsó formában levó következű trinukleotidot [a) szakasz] alkalmazzuk. AGA, TGT, GGT, CTG, TAC, TAG, CGT, CAA, TAA, GGT, CAT, GAA, GCG, CAT, CAA, AAC, CCT, GAT, CAG. A közepes kapcsolási kitermelés 96%. A végtermék struktúrája a következű:

MMT-CAGGATCCTAACCAACATGCGGAACATGGTTAACAACGTTAAGTACCTGGGTTGTAGAAAAC-polisztüol.

c) A DNS-fragment lehasítása a hordozóról és a nium-acetát (pH 7,0); B oldat: A oldat/acetonitril 1:1]: védőcsoportok lehasítása: 15 30% B A-ban 60% B A-ban 20 perc múlva 50 *C-on, 2

40,2 mg (kb. 0,66 pmól) komplementer DNS-szinté- ml/perc. A lipofil fócsúcsot (retenciós idű kb. 14 perc)

zisgyantát (172/61) 66 mg (0,40 mmól) o-nitro-benzal- gyűjtjük, DE52-cellulózoszlopon (Whatman) koncentdoximmal és 50 pl (0,40 mmól) 1,1,3,3-tetrametil-gua- ráljuk, eluáljuk és etanollal kicsapjuk. A 4-metoxi-trinidinnel 400 pl 95%-os piridinben 3 órán át 50 “C-on til-védűcsoport lehasításához a csapadékot 50 pl ecet-és 12 órán át szobahőmérsékleten tartunk. A piridin 20 sav/H20-ban (4:1) oldjuk és 45 percen át szobahűmérnitrogénnel való eltávolítása után a maradékot 1,6 ml sékleten tartjuk. A reakcióterméket liofilizáljuk, etanolvizes ammóniával (33%) elegyítjük és zárt edényben lal kicsapjuk és 8%-os poliakrilamid gélen (7 M karba-24 órán át 50 ’C-on tartjuk. mid) elektroforetikus elválasztással tisztítjuk. A várt

Az elválasztott folyadékfázist vákuumban megsza- DNS-méretnek megfeleld sávokat kivágjuk, a terméket badítjuk az ammóniától és 3-szor, egyenként 3 ml pero- 25 elektroeluláljuk, DE52-cellulózoszlopon koncentráljuk xidmentes dietil-éterrel mossuk. A kismolekulájú alko- és az 5’- CAGGATCCTAACCAACATGCGGAA tórészek Biogel P6 oszlopon [100-200 mesh, 3*66 cm, -CATGGTTAACAACGTTAGTACCTGGGTTGTA- 0,01 mól trimetil-ammónium-hidrogén-karbonát (pH -GAAAAC-3’ struktúrájú DNS-t etanollal kicsapjuk.

7,5), 1,5 ml/perc] történd elválasztása után 285 OD-nyi (260 nm) DNS-t izolálunk. Összesen 60 OD mennyisé- 30 6. példa

get HPLC-oszlopon választunk el (PRP-l/Hamilton, Az 5. példával analóg módon állítjuk eld a követke-250*4,6 mm). Grádiens [A oldat: 0,05 M trietil-ammó- zű (5’-3’) DNS-fragmenteket

1/40

CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTT

30/31 komplementer

AACAGTTTTACCAACAACTTCTGGGAAAGATTTCAGT

67/34

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACC

91/37 komplementer (C)

CCGGCAGGAAGTAAACGTCGTACTGCGGGTAATGCAG

91/37 komplementer (B)

CCGGCAGGAAATGAACGTCGTACTGCGGGTAATGCAG

124/61

CCGGAAGGTTCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACC

Továbbá a következű rövidített fragmenteket állítjuk élű:

1/40 (A 12) (C)

CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTT és 1/40 (A 18) (C”)

CTGGAATTCATGCTGAAATCTT

8. példa

Polimerizáció duplex lll-má (az eglin-C- és eglin-B- gének Fifragmentje)

50-50 pmól kinázzal kezelt 124/61 fragmentet és kinázzal kezelt 172/61 fragmentet 24 pl vízben oldunk, az oldatot 3 perc alatt 90 ’C-ra melegítjük és 5 percen

7. példa 55

A 30137, 67/34,124161 és 172/61 fragmentek foszforilálása

Az 5’-végek foszforilálása és radioaktív jelölése (y- 32P/ATP-vel és T« polinukleotid-kinázzal (Boehringer)] az üodalomban (19) leírt módon történik. 60

21