203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 A 3. ábra ennek megfelelően az eglin-C-, ill. -B-gén F2 fragmentjét klónozó vektor, a pML136 plazmid előállítását mutatja. A 4. ábra az Fi(C)-F2-DNS-t tartalmazó klónozó vektor szerkesztését szemlélteti. 5 Az 5. ábra a trp-promotert tartalmazó pHRil48 vektor előállítását szemlélteti vázlatosan. A 6. ábra a pML147 expressziós plazmid előállítását mutatja vázlatosan, amely a trp-prbmoter kontrollja alatt az eglin-C-gént [Fi(C)-F2-DNS] tartalmazza. 10 A 7. ábra az N-acetil-eglin-C aminosavszekvenciáját tartalmazza. A 8-11. ábrák a találmány szerinti eljárás végrehajtását szemléltetik reakcióvázlatokon. A következő példák kapcsán részletesen ismertetjük 15 a találmányt a korlátozás szándéka nélkül. Kísérleti rész A példákban használt rövidítések jelentése a következő: 20 TNE oldat, amely 100 mmól NaCl-t, 50 mmól Tris‘HCl-t (pH 7,5) és 5 mmól EDTA-t tartalmaz SDS nátrium-dodecil-szulfát EDTA etilén-diamin-tetraecetsav 25 DTT 1,4-ditiotreitol (1,4-dimerkapto-2,3-butándiol) BSA maiha-szérumalbumin EtBr etidium-bromid Tris trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán Tris»HCl a Trisz monohidro-kloridja 30 1. példa Védett nukleozid-polisztirolgyanta előállítása 20 ml absz. piridinben oldott 3,1 g (5 mmól) 5’-(4- metoxi-tritil)-N-benzoil-dezoxicitidint 750 mg borostyánkősavanhidriddel és 910 mg 4-dimetil-amino-piridinnel elegyítünk és 16 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A piridines oldat bepárlása után 200 ml etil-acetátban felvesszük, kétszer egyenként 200 ml 0,1 M foszfátpufferrel, telített konyhasóoldat hozzáadása közben kirázzuk, még egyszer mossuk konyhasóoldattal, szárítjuk, bepároljuk és hexánt csepegtetünk hozzá. A kivált terméket elválasztjuk és kétszer éterrel eldörzsöljük, majd 300 ml etil-acetátban oldjuk és 0 °C-on 180 ml (pH 2,5-ös) 0,1 M kálium- hidrogén-szulfáttal kirázzuk. Vízzel kétszer mossuk, majd az etil-acetátos oldatot nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, 0,5 ml piridinnel elegyítjük, bepároljuk és cseppenként hexánnal hígítjuk. A kivált borostyánkősav-származékot leszűrjük. Ebből a vegyületből 1,17 g-ot 190 mg N-hidroxiszukcinimiddel együtt 4 ml etil-acetátban és 2 ml dimetil-formamidban oldunk és 0 'C-on 370 mg NJí’-diciklohexil-karbodiimiddel elegyítünk. Egy éjszakán át hűtőszekrényben való állás után a kívánt N,N’- diciklohexil-karbamidot leszűrjük, a szűrletet etil-acetáttal hígítjuk, hideg 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonáttal s vízzel extraháljuk, szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot etil-acetáttal kovasavgélen kromatografáljuk. VRK: Rf 0,58 diklór-metán:metanol (9:1) elegyben. Ebből az N-szukcinimidoil-borostyánkősav-észterből 88 mg-ot 1 g amino-metil-polisztirollal (amintartalom 110 pmól/g) 2 ml diklór-metán és 4 ml dimetil-formamid elegyében 20 órán át keverünk. A polimergyantát leszűrjük és dimetil-formamiddal, metanollal, diklór-metánnal és metanollal kimossuk. Szárítás után a nem reagált aminocsoportokat acetilezzük oly módon, hogy a gyantát 6 ml piridinben 1 ml eeetsavanhidriddel és 100 mg 4-dimetil-amino-piridinnel 30 percen át keverjük. A polimergyantát diklór-metánnal, dimetil-formamiddal, metanollal és diklór-metánnal kimossuk és súlyállandóságig szárítjuk. A spektroszkópiai metoxitritil(MMT)-meghatározás 85 (imól/g töltöttséget ad. 2. példa Az 1. példával azonos módon állítjuk elő a következő védett nukleozid-polisztirolgyantákat: mmt-o-t-ocooh2ch2conhch2--(P) 5’-(4-metoxi-tritil)-trimidinből, tőltőttség 92 pmól/g MMT-O-G^-OCOCH^H^ONHCHj-(P) 5’-(metoxi-tritil)-N-izobutiril-dezoxiguanozinból, tőltőttség 75 pmól/g 3. példa A trinukleotid szintézise a) A dinukleotid szintézise 7,73 g (15 mmól) 5’-(4-metoxi-tritil)-timidint (MMT-O-T-OH) absz. piridinnel kétszer bepároljuk. A maradékot 20 ml absz. tetrahidrofuránban oldjuk és keverés közben a nedvesség kizárása mellett 80 ml, tetrahidrofuránnal készített 0,2 M 2-kIór-fenil-di(lbenztriazolil)-foszfát-oldatot csepegtetünk hozzá és a reakcióelegyet 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A kapott 2-klór-fenil-l-benztirazolil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfát-oldatot három részre osztjuk. a) Hidrolízis trietil-ammónium-2-klór-fenil-5’-(4- metoxi-tritil)-timidin-3 ’-foszfáttá; A 2-klór-fenil-1 -benztriazolil-5 ’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfát fenti oldatának egyharmadához hűtés közben 100 ml 0,5 M trietil-ammónium-bikarbonátot adunk. 15 perc elteltével diklór-metánnal extraháljuk. A diklór-metános oldatot vízzel mossuk, bepároljuk és cseppenként petroléterrel elegyítjük. A kapott csapadékot vákuumban szűrjük, 1:1 arányú éter-petroléter eleggyel kimossuk és vákuumban szárítjuk. VRK: Rf 0,35 diklór-metán/metanol/víz (75:22:3) elegyben. ß) 2-ciano-etil-2-klór-fenil-5*-(4-metoxi-tritil)- timidin-3’-foszfáttá észterezés és a 4-metoxi-tritil-védőcsoport lehasítása: A 2-klór-fenil-1 -benztriazolil-5 ’-(4-metoxi-tritil)-timidin-foszfát-oldat harmadához 1,3 ml 2-ciano-etanolt és 2 ml piridint adunk Az elegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, a maradékot etil-acetátban oldjuk és többször kirázzuk 0,1 M foszfátpufferrel (pH 7) és vízzel. A 35 40 45 50 55 60 19
