203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 pításához kompetitiv RIA mellett közvetlen kötéstesztet használhatunk. Ebből a célból az eglin-C-t mikrotitráló lapok vájataiban egy éjszakán át történő inkubálással rögzítjük (200 ng vájat), majd hibridomakultúra folyadékával inkubáljuk és, vagy radioaktív jelzett (I2SI)-(sziláid fázisú RIA)-val, vagy alkalikus foszfatázzal jelzett (szilárd fázisú ELISA)-val a kecske antiegér Ig-antitesteket láthatóvá tesszük. A kiválasztott három monoklonális antitest nemradioaktív tandem ELISA-hoz alkalmazható, amelynek segítségével az eglinszármazékok a testnedvekben mennyiségileg meghatározhatók. Az alkalmas antitestpárokat kompetitiv RIA segítségével a következőképpen választjuk ki: a 299S18-20, 299S22-1 és 299S22-10 jelzésű monoklonális antitesteket (200-300 ng vájat, amit ascites folyadék ammőnium-szulfátos kicsapásával kaptunk) és egy poliklonális nyúl anti-eglin-C antitestet (200- 300 ng vájat, szérumból kaptuk) a mikrotitráló lapok vájataiban rögzítjük. A 123I-tel jelzett eglin-C kötődésének gátlását keresztvizsgáljuk. A kísérletek azt eredményezték, hogy a 299S18-20 és 299S22-10 jelzésű monoklonális antitestek az eglin- C-hez való kötődéskor kölcsönösen gátolják egymást, amiből következik, hogy az eglin-C-molekulán mindkettő ugyanarra az epitopra kapcsolódik. A 299S18-20 és 299S22-1 jelzésű monoklonális antitestek kölcsönösen nem gátolják egymást. Ez azt jelenti, hogy az eglin-C-molekula különböző epitopjaira kapcsolódnak. A relatív kötőkapacitás, amit a rögzített antitesthez kötődött radioaktív jelzett eglin-C mennyiségéből határozunk meg, legnagyobb a 299S22-10 jelzésű és legkisebb a 299S18-20 jelzésű antitestre. A tandem ELISA kísérletek alapján, amelyek során a monoklonális antitesteket páronként teszteljük, mimellett az egyik antitest mindig a mikrotitráló lapokon volt rögzítve és a másik folyadékfázis formájában enzimmel, például alkalikus foszfatázzal volt jelezve, megállapítottuk, hogy a nem keresztreaktív párok - a 299S18-2Q/299S22-1 és a 299S22-1/299S22-10 - a legalkalmasabbak kvantitatív assay-hez, mimellett az említett monoklonális antitestpár első tagját, amely gyengén kötődik az eglin-C-hez, kell szilárd fázisként alkalmazni. A találmány szerinti monoklonális antitesteket - szilárd fázisként alkalmazva - folyadékfázisként alkalmazott poliklonális anti-eglin-C-antitesttel, például birkából, is kvantitatíve meghatározhatjuk. A tandem ELISA érzékenysége 1-10 ng eglin-C/ml minta. Gyógyszerkészítmények A találmány szerint előállítható ismert (pl. eglin-B és -C) és új (pl. Na-acetil-eglin-B és -C, metionil-eglin- C és -eglin-B) eglinszármazékok és módosított eglinszármazékok értékes farmakológiai tulajdonságokat mutatnak és mint az orvosi piócából extrahálható eglinszármazékok (vö. 2 808 396 számú NSZK-beli nyilvánosságra hozatali irat) profilaktikus vagy terápiás kezelésre alkalmazhatók. A találmány szerinti új eglinszármazékok, például az N°-acetil-eglin-B és Na-acetil-eglin-C a humán-leukocita-elasztáz (HLE), a leukocita-katepszin G (H.Kat.G) és a kimotripszin igen erős és specifikus inhibitorai. A következő táblázatban feltüntettük az Na-acetil-eglin-C és két természetben előforduló proteáz-inhibitor, az ai-proteináz-inhibitor (c^PI, korábbi elnevezése cti-antitripszin) és <X2-makroglubin (CC2M) HLE-vel és H.Kat.G-vel lejátszódó reakcióira a képződött enziminhibitor komplexek asszociációs-sebességi állandóit (kjua) és egyensúlyi állandóit (Ki): Táblázat Kiválasztott proteinázok és N“-acetil-eglin-C, ctiPI és (X2M inhibitorok kölcsönhatásának kinetikai paraméterei Fehérje Inhibitor k^M^see1] Ki[M] HLE (XiPI 1,5*107 irreverzibilis CC2M l,O107 irreverzibilis Na-acetil-eglin-C 1,4»107 8U0-11 H.Cat.G CtiPI 1.0-106 irreverzibilis a2M 3,5* 106 irreverzibilis Na-acetil-eglin-C 2,0106 5*10“ Feltételek: Az asszociációs-sebességi állandókat Bieth et al. (36) szerint határoztuk meg. Az N-acetil-eglin-C HLE-vel és H. Kat.G-vel való kölcsönhatására a Ki-értékeket a „steady state” reakciósebességekből azzal a feltételezéssel számoltuk, hogy a kölcsönhatás reverzibilis. Az összes értéket 37 °C-on és pH 7,4-en határoztuk meg. Az adatok azt mutatják, hogy az Na-acetil- eglin-C, valamint az ctiPI és ct2M természetes inhibitorok HLE- vel, ill. H.Kat.G-vel lejátszódó reakciójának asszociációs-sebességi állandói ugyanabban a nagyságrendben vannak. Az N“-acetil-eglin-enzim-komplexek nagy stabilitása (Ki-értékek), az eglinszármazékok bizonyított, rendkívül kis toxicitása, valamint a specifitásuk (más emlős- proteinázokkal, különösen a véralvadási, fibrinolízis- és komplement-rendszerhez tartozókkal nem figyeltek meg szignifikáns kölcsönhatást), az N-terminális acetilcsoport következtében megnövekedett stabilitásuk az aminopeptidázok proteolitikus lebontásával szemben, és az ciiPI és (X2M testi faktorokkal összehasonlítva a könnyű hozzáférhetőség nagy mennyiségben a találmány szerinti eljárással ezeket a vegyületeket alkalmassá teszi olyan kórképek farmakológiai kiértékelésére, amelyeket a HLE által okozott szövetlebomlás jellemez. A találmány szerinti vegyületek hatását például a kísérleti emfizéma-modellen mutatjuk be. Egy órával azelőtt, hogy hörcsögben 0,3 mg HLE alkalmazásával emfizémát indukálunk, 0,5 mg, ill. 2 mg N°-acetil-eglin-C-t (8-8 állatba) alkalmazunk hasonlóképpen intratracheálisan. A nem védett (Na-acetil-eglin-C-vel nem előkezelt) állatoknál a két hónappal később végzett légzésfunkció-vizsgálat és hisztológiai vizsgálatok 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 17
