203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 telményeket teljesítő homogén antitestek a Köhler és Milstein (26) által leírt hibridomatechnikával hozzáférhetők. A technika elve az, hogy immunizált állatok antitestet kiválasztó B-limfocitáit, például a lépből, tumorsejtekkel összeolvasztjuk („fuzionáljuk”). A képződött hibridomasejtek egyesítik az osztódás általi korlátlan szaporodás képességét azzal a képességgel, hogy egységes típusú antitestet képezzenek és válasszanak ki. Szelektív médiumban - amelyben a nem fuzionált tumorsejtek elpusztulnak, a hibridomasejtek azonban szaporodnak - történő tenyésztéssel és alkalmas manipulációkkal kiónokat, azaz egyetlen hibridomasejtből levezetett és genetikailag azonos sejtpopulációkat kaphatunk és tenyészthetünk és a sejtek által termelt monoklonális antitesteket izolálhatjuk. A találmány eglinszármazékok vagy módosított eglinszármazékok elleni monoklonális antitestekre, ilyen antitesteket termelő hibridomasejtekre és előállítási eljárásukra vonatkozik. Előnyösek azok a hibridomasejtvonalak és az ezekből kiválasztott monoklonális antitestek, amelyek az eglin-B-vel vagy eglin-C-vel vagy ezek származékaival, például N°-acetil-eglin-C- vel vagy -B-vel, vagy az N°-metionil- eglin-C-vel vagy -B-vel specifikusan reagálnak. A találmány eljárás monoklonális anti-eglin-antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy egereket eglinnel vagy módosított eglinnel immunizálunk, az így immunizált állatok B-limfocitáit myelomasejtekkel fuzionáljuk, a képződött hibridomasejteket klónozzuk, majd in vitro vagy egérbe injektálva tenyésztjük és a kultúrából antitestet izolálunk. A találmány továbbá immun-affinitáskromatográfiás oszlopokra és ezeket az antitesteket tartalmazó, immunassay kitekre vonatkozik. A találmány szerinti eljárással egereket, például Balb/c-egereket önmagában ismert, de specifikus módon immunizálunk. Meglepő módon az immunizálás sikerült, bár az eglinek viszonylag kis fehérjemolekulák. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában 50-500 pg, előnyösen 100 pg eglin-B vagy -C oldatát, előnyösen komplett és inkomplett Freund adjuvánsban és pufferrel készített sóoldatban oldva, hetenként vagy több hét, például 5-12 hét alatt nagyobb időközökben szubkután injektáljuk, míg elegendő számú antitesttermelő B-limfocita képződik. Az immunizált egerek B-limfocitákat tartalmazó szerveit, például a lépsejteket, kivesszük és olyan myelomasejtekkel fuzionáltatjuk, amelyek mutáció miatt szelektív tápközegben nem növekednek. Ilyen myelomasejtek ismeretesek éspedig, például az X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/1 vagy különösen az SP 2/0 jelzésiek. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában immunizált egerek lépsejtjeit az SP 2/0 sejtvonal myelomasejtjeivel fuzionáltatjuk. A fúziót önmagában ismert eljárás szerint a B-limfociták és a myelomasejtek sejtfúziót kiváltó szer, például polietilénglikol, Sendai-vírus, kalcium-klorid vagy lizolecitin, hozzáadása közben történő összekeverésével végezzük. A fúzió előnyösen polietilénglikol, például 500 molekulasúlyú, jelenlétében történik. A fúzió után a képződött hibrideket önmagában ismert eljárás szerint hipoxantinnal, aminopterinnel és timidinnel (HAT-médium) kiegészített szelektív tápközegben tenyésztjük. A nem fuzionált myelomasejtek ebben a közegben nem képesek növekedni és ugyanúgy elpusztulnak, mint a normál limfociták. A megmaradt hibridomakultúrák specifikus antitesttartalmát önmagában ismert eljárásokkal vizsgálhatjuk, például radioimmunassay-vel és agglutinálóval. Meglepő módon azt találtuk, hogy a leírt eljárással olyan hibridomasejteket kaphatunk, amelyek eglin -B vagy eglin-C elleni specifikus antitesteket választanak ki. Ezek az antitestek az N“-acetil-eglin-C-vel és -B-vel és az Na-metionil-eglin-C-vel és -B-vel is reagálnak. A kívánt specifitású antitesteket termelő hibridomasejteket a fuzionálással előállított legkülönbözőbb hibridomasejtek keverékéből klónozással szelektáljuk ki. Ehhez önmagában ismert eljárással, amit határhígításnak („limiting dilution”) neveznek, egyetlen növekvő sejből kiinduló kultúrákat képezünk. Ilymódon az a három hibridoma-sejtvonal állítható elő, amit a Pasteur intézetben 299S18-20,299S22-1 és 299S22-10 jelzéssel letétbe helyeztek. Tömegtermelés céljából a kívánt specifitású antitesteket termelő hibridoma-sejtklónokat vagy önmagában ismert közegekben in vitro tenyésztjük, vagy szaporítás céljából egerekbe injektáljuk. A találmány előnyös kiviteli formájában a hibridomasejteket Pristan-nal előkezelt egerekbe injektáljuk, az ascites folyadékot levesszük és abból ammónium-szulfát-oldattal való kicsapással antitestet izolálunk. A hibridomasejtek segítségével kapott monoklonális antitesteket önmagában ismert módon immun-affinitáskromatográfiás oszlopok előállítására alkalmazhatjuk. A találmány előnyös kiviteli formájában alkalmas hordozóanyagot (pufferoldatban szuszpendálva) antitestoldattal elegyítünk, a nem kötődött részeket ezt követően kimossuk és a hordozóanyag el nem foglalt helyeit blokkoljuk. A hibridomasejtek segítségével kapott monoklonális antitesteket önmagában ismert módon tesztkitek előállítására alkalmazhatjuk. Ezek különböző módszereken alapuló tesztkitek lehetnek, például radio-immundiffúzió, latex-agglutináció, foltpróbák, kompetitiv vagy „szendvics”-radioimmunassay, enzim-immunassay, immun- fluoreszcens vagy enzim-immunanalitika, például ELISA (heterogén enzim-immunanalitika, fáziselválasztással) vagy tandem-ELISA. Az ilyen kitek a különböző eredetű szokásos antitestek mellett enzimekkel vagy fluoreszcens reagensekkel kapcsolt antitesteket tartalmazhatnak, ezenkívül eglint vagy módosított eglint, például eglin-B-t, eglin-C-t vagy N-acetileglin-C-t, amely aktív izotóppal, például 123I-tel jelzett vagy enzimmel, például torma-peroxidázzal vagy alkalikus foszfatázzal kapcsolt, továbbá szubsztrátot, alkalmas puffert, géleket, latexet, polisztriolt vagy más töltőanyagot és hordozóanyagot. A szerológiai tesztet, például a következőképpen végezhetjük: az anti-eglin-C antitestaktivitás megálla5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16
