203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 vagy előnyösen kohézív végeket képző második restrikciós endonukleázzal, például BamHI-gyel emésztünk, majd az így linearizált vektort a megfelelő végekkel rendelkező eglin- (vagy módosított eglin-) génnel (például EcoRI-véggel az ATG-startkodon előtt és BamHI-véggel a transzláció stopkodonja után) összekapcsoljuk. Az összekapcsolás ismert módon a komplementer (kohézív) végek párképzésével és például TV DNS-ligázzal való kezeléssel történik. A mRNS-úton át, a genomból származó DNS-ből vagy szintetikusan előállított, megfelelő kohézív (különösen EcoRI- és BamHI) végekkel ellátott eglin- (vagy módosított eglin-) gén az expressziós plazmidba való bevitel előtt egy vektorban, például pBR322-ben szintén klónozható, hogy nagyobb mennyiségű struktúrgént kapjunk, például szekvenciaanalízis céljára. A hibridplazmidot tartalmazó kiónokat például eglinspecifikus, radioaktív jelzett oligodezoxinukleotidpróbával (lásd fent) izoláljuk. Az eglin- (ill. módosított eglin-) gén jellemzése például Maxam és Gilbert (3) eljárásával történik. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában az eglin- vagy módosított eglingén két fragmentjét, például az eglin-C-gén két fragmentjét szintetizáljuk. A gén 1. részét tartalmazó 1. fragment az ATG előtt és a végen mindig kohézív végeket képező restrikciós endonukleázok, például az ATG előtt EcoRI és a végen Hpall felismerési szekvenciáját tartalmazza. A gén következő részét tartalmazó 2. fragment megfelelő felismerési szekvenciákat tartalmaz, a fragment elején például Hpall és transzláció stopjele (pl. TAG) után Bam- HI felismerési szekvenciát A fragmenteket a külső felismerési szekvenciánál (az 1. fragmentet például EcoRI-gyel és a második fragmentet megfelelően BamHI-gyel) hasítjuk és egy megfelelően hozzájuk hasított vektorban (pl. pBR322) szubklónozzuk. A fragmenteket tartalmazó kiónok azonosítása és a fragmentek jellemzése a fenti módon történik. A fragmenteket ezután a megfelelő restrikciós endonukleázokkal kihasítjuk a hibridvektorokból (az 1. fragmentet például EcoRI-gyel és Hpaü-vel és a 2. fragmentet például Hpall-vel és BamHI-gyel) a kohézív végeiken, különösen Hpaü-végeiken keresztül összekapcsoljuk ezeket, mimellett a teljes eglin- (ill. módosított eglin-) gént kapjuk, amit a megadott módon vektor-DNS- be illesztünk. A gazdasejt transzformációja A találmány eljárás transzformált gazda előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely gazdát, expressziós kontrollszekvenciával szabályozott, eglint vagy módosított eglint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós plazmiddal transzformálunk. Az alkalmas gazdák baktériumok vagy élesztők, például a fenti mikroorganizmusok, így a Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis és különösen az Escherichia coli törzsei. A transzformációt a találmány szerinti expressziós plazmiddal, például az irodalomban leírt 5 módon végezzük, például S.cerevisiae-re (4), B.subtilis-it (5) és E.coli-ra (6). A transzformált gazdát előnyösen szelektív táptalajból izoláljuk, amelyhez olyan biocid anyagot adunk, amivel szemben az expressziós plazmidban található jelzőgén rezisztenciát kölcsönöz. 10 Ha előnyösen az expressziós plazmid amp®-gént tartalmaz, akkor ennek megfelelően a tápleveshez ampicillint adunk. Az expressziós plazmidot nem tartalmazó sejtek ilyen táplevesben elpusztulnak. A találmány az említett úton előállított gazdára is 15 vonatkozik. A transzformált gazda tenyésztése és eglin előállítása A transzfromált gazda eglin és módosított eglin elő- 20 állítására alkalmazható. A találmány tárgya eljárás egűnek és módosított eglinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a transzformált gardát tenyésztjük és a terméket a gazdasejtből szabaddá tesszük és izoláljuk. Meglepő módon azt találtuk, hogy a találmány sze- 25 rinti transzformált gazdák eglinaktivitású polipeptidek keverékét termelik. A keverékből természetes eglineket, metionil-eglineket és az N-terminálison acetüezett eglineket lehet izolálni. Az E.coli transzformált törzsei különösen olyan eglinaktivitású polipeptideket termel- 30 nek, amelyek a természetes eglin-B-től és -C-től az N-terminális treoninon található N-acetilcsoporttal különböznek, más transzformált gazdák túlnyomórészt természetes eglineket és a harmadik típusú gazdák mindenekelőtt olyan polipeptideket fejeznek ki, ame- 35 lyek pontosan a gazdába bevitt eglin-DNS-eknek felelnek meg, azaz N-terminális aminosavak metionin. Különösen az Na-acetilezett termékek képződése meglepő. Géntechnológiai módszerekkel ilyen polipeptidek képződését ugyanis eddig még nem figyelték meg. 40 Még maga az a-timozin, amely természetes álapotban N-terminálison acetilezett, megfelelő genetikailag módosított gazdából nem acetilezett formában fejeződik ki (35). Az N-terminálison acetilezett eglinek termelése 45 nagy előnnyel jár, mert ezeknek a vegyületeknek nagyobb a stabilitása a gazdasejtekben található aminpeptidázokkal szemben, ami az N-terminálisról kiinduló (részleges) proteolízist gátolja és ennek következtében a kitermelést növeli. Továbbá a tisztítási eljárás 50 ezzel lényegesen egyszerűsödik, mert a kívánt termék proteolízissel képződött fragmentekkel nem szennyezett. A találmány, ennélfogva eljárás (XIV) általános képletű eglinszármazékok -(Met),-B-ProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaAigGlu TyrPheThrLeuHis'iyrProGln'iyrAspValWPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAsp LeuArgTyrAsnArgValArgValPhe'IVrAsnProGlyThrAsnValValAsn-B’ (XIV) 12
