203783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szuperoxid-diszmutáz konjugátumok előállítására
1 HU 203 783 B 2 1. Táblázat PEG:SOD A SOD-adduktummá Adduktum (tömeg: (mól: alakulásának csúcs :tömeg) :mól) százaléka móltőmeg* 5 1,7 25% _ 10 3,3 29% 90K 20 6,6 62% 140K 50 16,7 90% 150K 75 24,0 95% 200K 100 33,3 100% 200K * Kereskedelmi PEG standarddal kalibrált TSK PW oszlopon meghatározva. Amint az 1. táblázatból látható, 50:1 PEG:SOD tömegaránynál (16,6:1 mólarány) a SÓD 90%-a alakult PEG-SOD-adduktummá, amelynek átlagos molekulatömege 150 000. Nagyobb PEG: SÓD arányoknál mind a PEG-SOD-dá alakult SÓD mennyisége, mind az adduktum molekulatömege emelkedett. Az adduktum kapott molekulatömege arra utal, hogy ilyen körülmények között, kapcsolószerként cianursavat használva 2-ig terjedő 100 000 móltőmegú PEG-lánc kapcsolódhat a SOD-hoz. 10:1 és 75:1 PEG:SOD tömegarányú PEG-SOD-termék szérummal szembeni ellenállását viszgáltuk egéren a 3. példában ismertetett módszerrel. Mindkét termék esetén legalább 36 óra felezési időt kaptunk. 5. Példa: Kapcsolási reakció 1,1-karbonil-diimidazollal 10 g, 100 kilodalton móltőmegú polietilén-glikolt (100K PEG, Union Carbide gyártmány) 24 óra hosszat fagyasztva szárítottunk a mintában jelen levő nedvesség eltávolítására. A szárított 100K móltőmegú PEG-et feloldottuk körülbelül 45 ml vízmentes acetonitrüben. Ezután hozzáadtunk 5,12 g 1,1-karbonü-diimidazolt, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 1,5 óra hosszat inkubáltuk. Ezután ionmentes vízzel lehútöttük a karborul-diimidazol feleslegének elbontására. Az aktivált PEG hidrolízisének megakadályozására a pH-t 7 értéken tartottuk. Az elegyet ezután 1 napig 4 'C hőmérsékleten 4 liter desztillált vízzel szemben, legalább 10-szeres cserével dializáltuk, az acetonitril és az imidazol eltávolítására. Dialízis után az aktivált PEG-et Sephacryl S-400 oszlopon kromatografáltuk ionmentes vízzel, az aktivált 100K móltőmegú PEG és a kis móltömegú fragmentumok elválasztására. A kapott aktivált PEG-hez annyi SOD-ot adtunk, hogy a PEG: SÓD mólarány 3 legyen. Az adagolt SÓD mennyisége 92,8 mg (108 ml). Az elegyet négyszer fagyasztva szárítottuk a kívánt PEG-O-CO-SOD- termék kialakítására. 6. Példa: Kapcsolási reakció PEG-éter--karbonsavval 30 g polietilén-glikol 1100 ml vízmentes dioxánnal készült oldatához 35 °C hőmérsékleten, nitrogénatmoszférában, keverés közben lassan hozzáadtunk 10 g nátrium-hidridet. A keverést 25 ”C hőmérsékleten még egy óra hosszat fenntartottuk, majd hozzáadtunk 15 ml etü-bróm-acetátot. Az elegyet 25 "C hőmérsékleten 30 percig, majd 45 *C hőmérsékleten 2 óra hosszat kevertük, majd a reakciót 200 ml víz adagolásával leállítottuk. Ezután keverés közben hozzáadtunk 400 ml petrolétert. A szerves fázist eldobtuk, és a viszkózus vizes fázist petroléterrel mostuk. A PEG-edl- észtert tartalmazó vizes fázist körülbelül 1 literre hígítottuk, és 5 óra hosszat 60-70 ”C hőmérsékleten melegítve hidrolizáltuk. Végül az elegy pH-2 értékre savanyításával a PEG karboxilcsoportjait felszabadítottuk. A maradék bróm-ecetsavat dialízissel vagy gélszúréssel eltávolítottak. Az így kapott PEG- éter az 1. példában alkalmazott szukcinilezett PEG helyett használható. így 9,4 g 40 000 móltőmegú aktivált polietüén-glikolt és 7,9 mg szarvasmarha SOD-ot alkalmazva olyan adduktumot kaptunk, amely SÓD molekulánként átlagosan 3,3 PEG-láncot tartalmazott. A termék molekulatömege HPLC-vel meghatározva körülbelül 140 000. Ez az adduktum jelentőísen csökkent immunogenitást mutat egerekben. 6,5 g, 120 000 móltőmegú polietüén-glikol és 87 mg szarvasmarha SÓD alkalmazásával körülbelül 245 000 móltőmegú (HPLC-vel meghatározva) terméket kapunk. 7. Példa: Humán SOD-PEG-adduktum előállítása Az eljárást humán SÓD alkalmazásával végezzük. 20 mg aktivált, szukcinilezett PEG-et üvegcsőbe helyezünk. Hozzáadunk 100 pl 3 mg/ml koncentrációjú humán SOD-ot, 0,2 mól/literes foszfát-borát-pufferben, pH-8. Összekeverés után 2 pl-es mintákat vettünk ki, és 58 pl 0,01 mól/literes, 1:1 arányú nátriumacetát:ecetsav pufferrel hígítva 250 pl-es mikrocsövekbe helyeztük. A reakció lefolyásának ellenőrzésére mintákat pH-8,5-nél, 250 V feszültséggel 15 percig elektroforézisnek, majd nitro-kék-tetrazóliumfestésnek vetettük alá. Az elegyet 3-3,5 óra hosszat szobahőmérsékleten tartottunk, majd 45 pl, 0,03 mólos 1:1 acetátpuffer/mg PEG segítségével hígítottuk. Az oldat végső pH-ját 0,1 ml 8-as pH-jú reakciópufferrel és 0,9 ml 30 mmól/literes acetáttal 6,4 értékre állítottuk. Ez a pH-csökkentés és az 1:10 arányú hígítás a további PEG-SOD kapcsolást és hidrolízist leállítota. Úgy találtuk, hogy 30-45 perc múlva észlelhető további reakció már nem volt. A 19 000 dalton PEG-láncot tartalmazó PEG-SOD- adduktum, valamint a szabad SOD 1 nappal az injekciózás után nem volt detektálható az egér szérumában, a 30 000 dalton PEG-láncokat tartalmazó készítmény azoban meghosszabbodott ellenállási időt mutatott A humán SÓD tehát alkalmazható a találmány szerinti eljárásban. 8. Példa: Gyulladáscsökkentő hatás vizsgálata Egéren végzett, karragénnel indukált mancs-ödéma tesztet végeztünk gyulladásgátló aktivitás meghatározására. 0,03 ml 1,0%-os, sóoldatban oldott karragént injektáltunk szubkután nőnemú Swiss Webster egerek jobb hátsó talpában, majd 30 perccel ezután az állatoknak 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
