203783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szuperoxid-diszmutáz konjugátumok előállítására
1 HU 203 783 B 2 szubkután 100 ni vizsgált vegyületet adtunk, amelyet szűréssel végzett sterilizálás után sóoldattal hígítottunk. 24 órával a karragén injekció után az állatokat levágtuk, és mindkét hátsó lábukat amputáltuk és megmértük. Az ödémát a kezelt láb (jobb) és a nem kezelt láb (bal) tömegének különbségéből számítottuk. Számítottuk az átlagot, és az ödéma tömegének standard deviációját az összes csoportban, beleértve egy sóoldatos kontrollt is. Egerenként 30 )ig dózisban adagolt addukt, amely átlagosan 2,6, 45 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazott, hatékonyabbnak bizonyult az ödéma csökkenté-sében, mint egy olyan adduktum, amely 3,4 21 000 mól-tömegű PEG-láncot tartalmazott (43% gátlás, szemben a 14%-kal). Egy három 120 000 móltömegű PEG-láncot tartalmzó adduktum 41% ödémagátlást mutatott 10 pg/egér dózisban. A natív szarvasmarha réz-cink-SOD inaktívnak bizonyult ebben a vizsgálatban, míg 300 pg/egér dózisban is, ugyancsak inaktívnak mutatkozott egy 14 5000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó adduktum 100 pg/állat dózisban. 9. Példa: Antigenitási vizsgálat Antigeniási vizsgálatiján egy szilárd fázisú, kompetitiv módon kötő enzim immun vizsgálatot (ELISA) végeztünk a szarvasmarha réz-cink-SOD-ot tartalmazó PEG-SOD keresztreaktivitásának vizsgálatára a nagy tisztaságú natív szarvasmarha réz-cink-SOD-dal szembeni nyúl antitestekkel. A találmány szerinti eljárással előállítót konjugátumokhoz kevesebb PEG-lánc volt szükséges ahhoz, hogy a vegyület antigenitását csökkentsék, mint azon vegyületek esetén, amelyeket rövidebb láncokkal, például 5000 móltömegű PEG-láncokkal készítettünk. így például egy átlagosan 2,6, 45 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó adduktum és egy négy 35 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó adduktum egyharmad, illetve egytized olyan antigén volt, mint a hat 5000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó adduktum. A négy 35 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó adduktum fele olyan antigén volt, mint egy tizennégy 5000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó. A kevesebb, mint 4 PEG-láncot tartalmzó adduktumok közül azok, amelyek 100 000-120 000 móltömegű PEG-láncot tartalmaztak, kevésbé voltak antigének, mint az ugyanolyan számú, rövidebb láncokat tartalmazó adduktumok. így a két 120 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó SOD-adduktum csak ötöd olyan antigén volt, mint a két 35 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás vízoldható, nem immunogén, olyan polietilén-glikolhoz kapcsolt szuperoxid-diszmutáz konjugátum előállítására, amelynek a terminális csoportjai szabadok vagy 1—4 szénatomos alkoxicsoporttal vannak helyettesítve, és amely konjugátumban a polietilén-glikol terminális csoportjai karbonilcsoporton keresztül kapcsolódnak a szuperoxid-diszmutáz lizinmaradékainak epszilon-aminocsoportjaihoz, azzal jellemezve, hogy 40 000 és 1 000 000 közötti átlagos molekulatömegű polietilén-glikolt önmagában ismert módon aktiválunk, majd az aktviált terméket szuperoxid-diszmutázzal reagáltatjuk, amelynek során 1 mól szuperoxiddiszmutázra számítva 1-8 mól polietilén-glikolt alkalmazunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 40 000-200 000 átlagos molekulatömegű polietilén-glikolt alkalmazunk. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 40 000-150 000 átlagos molekulatömegű polietilén-glikolt alkalmazunk. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve^ hogy 1 mól réz-cink-szuperoxid-diszmutázra számítva 2-8 mól polietilén-glikolt alkalmazunk. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1 mól szuperoxid-diszmutázra számítva 2-6 mól polietilén-glikolt alkalmazunk. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy helyettesített polietilén-glikolként izopropoxi-polietilén- glikolt alkalmazunk. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polietilén-glikol aktiválásához a terminális hidroxilcsoportjaiból észter-, karboxil-, amino-, karboxamido- vagy aldehidcsoportot alakítunk ki. 5 10 15 20 25 30 35 40 7
