203783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szuperoxid-diszmutáz konjugátumok előállítására
1 HU 203 783 B 2 szerinti eljárással előállított PAG-SOD-adduktum és más PAG-adduktumok általában megtartják a natív protein enzimaktivitásának jelentős mértékét. (Megjegyezzük, hogy a jelen leírásban molekulatömegen az ismert molekulatömegű PEG-standard alapján mért molekulatömeget értjük.) A találmány szerinti eljárással előállított adduktumok egy másik előnye, hogy nagy molekulatömegű PAG alkalmazásával nagyobb adduktumok állíthatók elő, mint az ismertek. Bizonyos alkalmazási területeken a nagyobb PAG-adduktumok nyilvánvalóan előnyösebbek. így például a találmány szerinti eljárással előállított PEG-SOD- adduktumok, amelyeket 40 000-130 000 molekulatömegű PEG-láncokkal állítottunk elő, egerekben körülbelül 35-36 óra vagy ennél nagyobb szérumbeli felezési időt mutatnak, amely hosszabb, mint az ismert PEG-SOD-adduktumoké, amelyek felezési ideje maximum 24-28 óra. A PAG-SOD-adduktumok proteinmolekulánként előnyöen 1-10 kapcsolódó PAG-láncot, előnyösebben 2-8, még előnyösebben 2-6 PAG-láncot tartalmaznak. A kellő szérumbeli ellenállóképesség eléréséhez kevesebb lánc szükséges, ha hosszabb láncokat alkalmazunk. A találmány szerinti eljárással előállított SOD-készítmények emlős eredetű, borjútól vagy más állattól (például birkától, lótól, sertéstől, kutyától, nyűitől, csirkétől) vagy humán sejtekből származó szuperoxid-diszmutáz enzim réz- és cinktartalmú formáját tartalmazzák. Hozzáférhetők olyan SOD-készítmények is, amelyek más fémionokat, például vasat vagy mangánt tartalmaznak. Alkalmas az olyan enzim is, amely rokonszerkezettel rendelkezik, és amely olyan mikroorganizmus tenyészetből származik, amelyben ilyen szerkezetet klónoztak és kifejeztek. Az alkalmazott SÓD lehet olyan protein is, amely nem azonos a természetben előforduló proteinekkel, az ilyen mikrobiológiai tenyészetekben történő transzláció tökéletlensége következtében, mivel a találmány szerinti eljárásban előállított termék csökkent immunogenitással rendelkezik. Úgy találtuk továbbá, hogy ha a SOD-készítmény nem SOD-proteinek nyomait is tartalmazza, amelyek egyébként az ilyen készítményeket immunolőgiailag nem teszik biztonságossá az ismételt parenterális adagolásra, a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy az ilyen termék is használható legyen, mivel a szennyező proteinek lényegesen kevésbé immunogénné alakíthatók. A kapcsolási eljárásban számos szokásos reakció használható. Egy előnyös reakció során PAG-O-CO-X képletű reaktív karbonsav-félésztert képezünk, ahol X egy könynyen távozó csoportot képvisel, a reakciót karbonil-diimidazol, p-nitro-fenil-kloroformát vagy bisz-N-szukcinimidil-karbonát segítségével hajtjuk végre. Az aktivált PAG-ot, azaz a PAG-O-CO-X képletű vegyületet azután a proteinnel reagáltatjuk, olyan körülmények között, amelyek nem rontják le enzimaktikus aktivitását, és amelynek során elsősorban PAG-O-CO-NH-protein képletű uretán kapcsolat jön létre, amely a protein aminocsoportjain, mint például lizin epszilon-aminocsoportján keresztül kapcsolódik. A karbonil-diimidazol például reagáltatható a PAG terminális hidroxilcsoportjaival. A reakcióelegyet vizes oldatban semleges pH-nál lehűtjük, és az aktivált PAG-ot (polialkilén-glikol-karbonil-imidazol) dialízissel és/vagy méretkizárásos kromatográfiával izoláljuk. A PAG-O-CO-N-CH-I^ és SÓD reakcióját oldatban CH - CH hajtjukvégre az aktivált PAG fölöslege jelenlétében. A reakció egyik változatában a SÓD oldatát és az aktivált PAG-ot fagyasztva szárítjuk. A kapcsolt terméket méretkizárásos kromatográfiával egyszerűen izolálhatjuk. Más tisztítási módszert is alkalmazhatunk, így például ioncserélő kromatográfiát. Egy másik kapcsolási reakcióban a polialkilén-glikolt egy inert szerves oldószerben oldjuk, a reakcióelegyet enyhén alkálikussá tesszük és cianur-kloriddal reagáltatjuk. Az el nem reagált cianur-kloridot úgy távolítjuk el, hogy a PAG-ot petroléterrel kicsapjuk. A maradék oldószert lepároljuk, és így 2-PAG-6-klór-1,3,5-triazint kapunk. A kapott aktivált polimereket ezután alkalmas pufferten, például borátoldatban SOD-dal reagáltatjuk. Az el nem reagált aktivált PAG-ot eltávolítjuk, és a terméket kromatográfiásan izoláljuk. így 4-hidrox i-1,3,5-triazint kapunk, amelyhez a 2-es helyzetben a PAG-O-képletű polialkilén-glikol-csoport, míg a 6-os helyzetben a SÓD reaktív lizincsoportjának epszilon-aminocsoportja kapcsolódik. A PAG-OH egy vagy több hidroxilcsoportja szintén karboxilcsoporttá alakítható, például úgy, hogy borostyánkősav-anhidriddel vagy etil-bróm-acetáttal és lúggal reagáltatjuk, vagy a terminális -OCH2CH2OH csoportot alkálifém-permanganáttal oxidáljuk, így PAG-O-CH2-COOH képletű PAG-ecetsav-étereket kapunk. A karboxilcsoportokat ezután valamely, a proteinek módosítására alkalmas ismert módszerrel aktiváljuk, például N-hidroxi-szukcinimid-észter képzésével egy karbodiimid és N-hidroxi-szukcinimid reakciója útján, vagy acil-azid képzésével az acil-hidrazid nitrozálása útján. Az aktivált PAG-ot azután a proteinnel reagáltatjuk olyan körülmények között, amelyek nem rontják le a protein enzimatikus aktivitását, amelynek során elsősorban amidkötések jönnek létre [PAG-C(-0)NH-protein] a protein aminocsoportjain keresztül (mint például aminoterminális NH2-csoportok, és a lizin epszilon-aminocsoportjai). A PAG egy terminális hidroxilcsoportja szintén aminocsoporttá alakítható például úgy, hogy először tionilbromiddal reagáltatjuk, majd a kapott PAG-Br terméket ammónia fölöslegével aminolízisnek vetjük alá, így PAG-NH2 képletű terméket kapunk. Az amino-PAG azután amidcsoportokon keresztül közvetlenül kapcsolható a protein karboxilcsoportjaihoz. Kapcsolási reagensként használható például vízoldható karbodiimid vagy Woodward-féle reagens. Az aminocsoportok viszont karboxilcsoporttá alakíthatók például úgy, hogy borostyánkősav - anhidriddel reagáltatjuk, amelyet azután aktiválunk és a proteinnel reagáltatunk a fenti módon. A PAG terminális -CH20H-csoportjai aldehidcsoportokká alakíthatók például mangán-dioxidos oxidá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
