203783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szuperoxid-diszmutáz konjugátumok előállítására
1 HU 203 783 B 2 dóval. Az aldehidcsoportok azután reduktív úton alkilezhetők a proteinre ennek aminocsoportjain keresztül, például ciano-bór-hidriddel, így elsősorban a szekunder aminocsoportokon keresztül kialakuló kötések képződnek PAG-OCHjCHjNH-protein hidakat képezve. A protein aminocsoportjai mellett a protein karboxil- és szulíhidril-csoportjai szintén felhasználhatók arra, hogy a polialkilén-glikollal kapcsoljuk. Amint fent említettük, a kapcsolási reakciók kiválasztásakor azokat részesítjük előnyben, amelyek a PAG és a protein összekapcsolásában kialakuló hídban szénből, oxigénből, kénből, nitrogénből és hidrogénből álló nemaromás csoportokhoz vezetnek. A SÓD konjugátum a reakcióelegyből izolálható, előnyösen az idegen ionok eltávolítására végzett dialízis után, szokásos liofilizásái módszerekkel. Kívánt esetben a konjugátum tovább tisztítható ioncserélő kromatográfiával, elektroforézissel és/vagy gélszűréssel. Mikroporózus szűrőn szokásos módszerrel steril fiolákba történő szűréssel, adott esetben az ionerősség izotóniás értékre történő állítása után, amelyet például nátrium-kloriddal és/vagy nátrium-foszfáttal végzünk, steril oldatot kapunk, amely injekciós adagolásra alkalmas. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények a találmány szerinti eljárással előállított PAG-SOD-konjugátumokat tartalmazzák farmakológiailag elfogadható hordozó mellett. A gyógyszerkészítmények előnyösen steril injekciós készítmények például steril injektálható vizes oldatok. Az oldatok ismert módszerrel készíthetők el, alkalmas farmakológiailag elfogadható hordozók alkalmazásával. A steril injektálható készítmények lehetnek nemtoxikus parenterálisan elfogadható hígítószerrel vagy oldószerrel készült oldatok vagy szuszpenziók is. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények a SOD-konjugátum egy hatásos dózisegységét tartalmazzák olyan koncentrációban, amely a kívánt válasz kiváltására képes, amikor a dózisegységet az illető farmakológiai hordozónak megfelelő úton adagoljuk. így például a folyékony kompozíciók rendszerint 0,5-40 mg protein-konjugátumot tartalmaznak 0,25-10 ml, előnyösen 0,5-5 ml készítményben, kivéve az intravénás infúziós oldatokat, amelyek hígabbak is lehetnek, így például 05-200 mg SOD-konjugátumot tartalmazhatnak 50- 1000 ml, előnyösen 100-500 ml infúziós oldatban. A tabletták, kapszulák és kúpok rendszerint 0,1-25 mg, előnyösen 1-10 mg protein-konjugátumot tartalmaznak dózisegységenként. A találmány szerinti eljárással előállítót SOD-konjugátumok, az orgotein készítményekhez (kereskedelmi SOD-készítmények) hasonlóan, különböző gyulladásos állapotok kezelésére hatásosak, így például olyan esetekben, ahol a szintetikus gyulladásgátlő szerek kevésbé használhatók, például a hosszú használat miatt kialakuló toxikus mellékhatások következtében. Közelebbről, a SOD-konjugátumok alkalmazhatók oxigén-toxicitás, újraáramoltatási sérülés és gyulladásos állapotok javítására, és ezek hatásának enyhítésére, például különböző emlősöknél a húgyutak esetén. Használhatók baleset utáni ízületi gyulladással kapcsolatos tünetek és szerkezeti elváltozások, továbbá reumás betegségek, mint például bursitis, ínygyulladás és csont-ízületi gyulladás enyhítésére. A találmányt az alábbi nem korlátozó példákkal illusztráljuk közelebbről. 1. Példa: PEG-SOD-addukt előállítása 50 g PEG-et (Polyox®, Union Carbide gyártmány, vagy polietilén-oxid, amely izopropoxilezett PEG-ből áll, molekulatömege 10Ó 000, belső viszkozitással nyerve, amelyre a HPLC körülbelül 50 000 átlagos értéket ad) feloldunk 1 liter vízmentes piridinben, és hozzáadunk 22 g borostyánkősav-anhidridet Az elegyet 38 óra hosszat 60 °C hőmérsékleten keverjük. Az oldószert vákuumban 60 °C alatti hőmérsékleten eltávolítjuk, és a maradékot feloldjuk 500 ml vízben. Az oldatot hexánnal mossuk, majd 1000 ml kloroformmal extraháljuk. A kloroformot vákuumban 40 °C hőmérsékleten eltávolítjuk, és a maradékot benzolban oldjuk. A szukcinilezett PEG- et kétszer kicsapjuk a benzolból petroléterrel. A kapott szukcinilezett PEG vizes oldatát ultraszűréssel méret szerint frakcionáljuk egy Millipore® Minitan® berendezéssel, amely 300 000 molekulatömeghatár (protein standard) biztosító membránnal van ellátva, a kis molekulatömegű PEG eltávolítására. A méret szerint frakcionált terméket vákuumban megszárítjuk. A méretkizárásos vizes HPLC analízis azt mutatja, hogy a szukcinilezett PEG átlagos molekulatömege a ultraszűrés hatására körülbelül 50 000-ről körülbelül 80 000-re emelkedett. A kapott, méret szerint frakcionált szukcinilezett PEG-et ezután N-hidroxi-szukcinimiddel aktiváljuk. 12 g szukcinilezett PEG-et (molekulatömeg 80 000, 0,15 mmól) feloldunk 120 ml vízmentes dimetil-formamidban, és keverés közben hozzáadunk 300 mg (2,6 mmól) N-hidroxi-szukcinimidet. Oldás után hozzáadunk 2,4 mmól diciklohexil-karbodiimidet, és az oldatot 40 "C hőmérsékleten 30 percig keverjük, majd keverés nélkül 24 ‘C hőmérsékleten 5 napig állni hagyjuk. Az elegyet ezután egy üvegszál szűrőn leszűrjük, a szűrletet vákuumban 40 °C hőmérsékleten szárazra pároljuk. A maradékot enyhe melegítés közben 200 ml vízmentes toluolban feloldjuk. Az N-hidroxil-szukcinimidil- PEG-et 400 ml petroléterrel kicsapjuk. A terméket vákuumban üvegszál szűrőn összegyűjtjük, majd toluolból petroléterrel újra kicsapjuk, és vákuumban megszárítjuk. A méretkizárásos HPLC azt mutatja, hogy a tennék molekulatömege az aktiválás közben nem változik. 80 mg borjú Cu, Zn-SOD (2,46 pmól, 4400 egység/mg, DDI Pharmaceuticals, Inc. gyártmány) 39 ml 0,1 mól/literes kálium-foszfát-pufferrel készült oldatát (pH-8,0) hozzáadjuk 4 g száraz N-hidroxil-szukcinimidil-PEG-származékhoz (50 pmól), és az elegyet 24 'C hőmérsékleten feloldjuk. A méretkizárásos HPLC analízis azt mutatja, hogy a kapcsolási reakció lényegében véve végbemegy 15 óra alatt, amit az el nem ragált SÓD eltűnése és a nagy molekulatömegű UV-abszorbeáló ad-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
