203783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szuperoxid-diszmutáz konjugátumok előállítására
1 HU 203 783 B 2 A találmány tárgya új szuperoxid-diszmutáz konjugátumok előállítására szolgáló eljárás. Közelebbről, a találmány olyan szuperoxid-diszmutáz (SÓD) konjugátumok vagy adduktumok előállítására vonatkozik, amelyekben a SOD amino-, karboxil- vagy szulfhidril-csoportjainak legalább egy része polialkilén- glikollal (PAG), mint például polietilén-glikollal (PEG) vagy polietilén-polipropilén-glikol kopolimerrel van kapcsolva, ahol a PAG molekulatömege nagyobb, mint 20 000, előnyösen az átlagos molekulatömege 40 000 és 1 000 000 dalton közötti. Hacsak másképpen nem jelezzük, a PAG molekulatömegén azt a molekulatömeget értjük, amelyet PEG standard alkalmazásával nagy sebességű, méretkizárásos folyadékkromatográfiával (HPLC) határozunk meg. A PAG átlagos molekulatömege előnyösen nagyobb, mint 40 000 és nem nagyobb, mint 200 000, különösen előnyösen 50 000-150 000. A PAG lehet lineáris vagy elágazó szénláncú, és lehet nem helyettesített vagy 1-4 szénatomos alkil- vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoportokkal helyettesített. Különösen előnyös, ha két SÓD molekulát olyan PAG molekulák kapcsolnak össze, ahol egy terminális csoportként 1-4 szénatomos alkoxicsoport, mint például izopropoxicsoport van jelen. A korábbi megoldásokban alkalmazott PEG vagy metoxi-PEG kis molekulatömegű, rendszerint körülbelül 5000 vagy ennél kisebb molekulatömegű, amelyet szuperoxid-diszmutázzal vagy más proteinekkel kapcsoltak olyan adduktumok előállítására, amelyek különböző fokban mutatnak (a) fokozott elnyújtott aktivitást a szérumban, és (b) csökkent immunogenitást Azonban az (a), valamint (b) jellemzők elérése érdekében végzett, a proteincsoportok kis molekulatömegű PEG vagy metoxi-PEG segítségével történő módosításának mértéke gyakran vezet az enzimaktivitás vagy biológiai aktivitás lényeges veszteségéhez. így például Pyatak és munkatársai (Rés. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 29, 113-127, 1980) kimutatták, hogy 7-18 (egyenként 5000 móltömegű) metoxi- PEG-lánc kapcsolása a SOD-hoz olyan adduktumot eredményez, amelynek felezési ideje egerekben kb. 25 óra, az enzimaktivitása azonban a natív enzim aktivitásának mindössze 50-60%-a. Kevesebb 5000 móltömegű PEG kapcsolása magasabb enzimaktivitású adduktumot eredményez, azonban ekkor a szérummal szembeni ellenállóképesség csökken (kb. 10 óra). Yoshimoto és munkatársai (Jpn. J. Cancer Res. 77, 1264-1270,1986) a L-aszparagináz kapcsán megfigyelt problémákat úgy proóbálták megoldani, hogy egy olyan klór-triazin-származék reagens használatával kevesebb proteincsoportot módosítottak, amely két metoxi-PEG- lánccal volt helyettesítve, amely láncoknak a móltömege a mások által használtakénak a nagyságrendjébe esett (5000 vagy kevesebb). A cianur-klorid azonban az állatokra nézve toxikus, és a szakemberek nem szívesen visznek be triazingyűhlt egy olyan adduktumba, amelyet gyógyszergyártás céljára alkalmaznak, mivel ezt a kémiai csoportot immunogénnek tartják. Yabuki és Iwashita a 200 467 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentésben a metoxi-PEG-et PEG-gel helyettesítette, amelynek molekulatömege megegyezik a mások által alkalmazottal, olyan SOD-kopolimer-adduktumok előállítása céljából, ahol a PEG két vége különböző SÓD molekulákhoz kapcsolódik. Az ilyen adduktumok felezési ideje a szérumban 4-8 óra. Más szakemberek, példái Lee és Sehon (Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 56, 159-170, 1978), Lee és Sehon (id. 56, 193-206, 1978) és Mueller és munkatársai (id. 68, 312-319, 1982 és id. 68, 320-235, 1982) már korábban használtak olyan móltömegű (6000-20 000) PEG-et, mint Yabuki és Iwashita adduktumok előállítására, amelyek valószínűleg hasonló kopolier szerkezettel rendelkeztek. Wie és munkatársai (Int. Archs. Allergy Appl. Immun, 64, 84-89, 1981) és Lee és munkatársai (id. 64,100-114,1981) PEG-et célzatosan (2000-20 000 móltömegú) metoxi-PEG-get helyettesítették, hogy az esetleges inter- és intramolekuláris kötések kialakulását meggátolják. A szuperoxid-diszmutáz (SÓD) egy intracelluláris enzim, amely a szuperoxid-gyök oxigénné vagy hidrogénperoxiddá alakításának katalizálásáért felelős. A találmány célja egy olyan termék előállítása, amely in vivo ellenállóbb, mint a natív SOD-protein, továbbá a vesék által történő inaktiválás késleltetése. Különösen fontos az, hogy a termék hosszú ideig megtartsa enzimaktivitását, miközben immunogenitása alacsony. A találmány célja továbbá olyan konjugátum előállítása, amely gyulladásgátló aktivitással rendelkezik, ahogyan ezt a szokásos karragénnel indukált mancs-ödéma tesztben bemutatjuk. Ez az aktvivitás különösen alkalmassá teszi a terméket arra, hogy reumás állapotok kezelésére alkalmazzuk. A találmány szerinti eljárással előállított konjugátumok előnyösebbek a korábban ismerteknél abban, hogy kevesebb PEG-lánc kapcsolásával az eredeti aktív molekula kevesebb kémiai módosításon megy át, így az eredeti molekula jellemzőiből több marad meg. így, mivel a találmány szerinti eljárásban kevesebb nagy molekulatőmegű PEG-láncot kapcsolunk, az adduktum az eredeti molekula aktivitásának nagy részét, hacsak nem az egészét megtartja, miközben fokozott ellenállóképességet mutat a vérben. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható PAG molekulatömege több, mint 20 000. Az alkalmazott PAG bármely vízoldható alkilén- oxid-polimer lehet, például poli(etilén-oxid) vagy etilén-oxid és propilén-oxid bizonyos kopolimeijei. A PAG lehet egyenes vagy elágazó szénláncú, és egy vagy több hidroxilcsoportján tartalmazhat 1-4 szénatomos alkoxicsoport- vagy más kémiai csoport-helyettesítőt. Az alkalmazott PAG-polimer molekulatömege nagyobb, mint 20 000, és előnyben 40 000 és 200 000 közötti. 200 000-nél nagyobb molekulatömegű polimerek is alkalmazhatók, ezek azonban nem előnyösek nagyobb viszkozitásuk és a nyíróerőkkel szembeni érzékenységük miatt A találmány szerinti eljárással előállított PAGSOD-adduktum molekulatömege (az ismert molekulatömegű PEG-standard alapján mérve) körülbelül 85 000 és 2 000 000 dalton közötti, előnyösen körülbelül 90 000 és 1 000 000 dalton közötti. A találmány 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
