203734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bisz(hidroxi-metil)-ciklobutil-purinok és pirimidinek, valamint az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

1

Hü 203 734 B

2

nek eredményeként a vár t tennék marad vissza.

H) (7 a, 2 ß, 3a)-5-Amino~3-[2,3-bisz(hidroxi-me - til)-ciklobutilJ-3,6-dihidro-7H-l,2,3-triazolo[4,5 -dJpirímidin-7 -on

A fent leírtak szerint előállított (la,2ß,3a)-3-[5- 5 amino-7-(benzil-oxi)-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimi din-3-il]-l,2-ciklobután-dimetanol nyersterméket felszuszpendáljuk 1,5 ml metanolban, hozzáadunk 600 pl 3 n sósavat, és 4 órán át 45 "C-on, majd 16 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk reagálni. Az oldatot, 10 miután 1 n kálium-hidroxid-oldattal a pH-ját 7 -re állítottuk, szárazra pároljuk és 34 ml CHP-20P gyantán kromatografáljuk. Az eluálást koncentrációgrádiens alkalmazásával végezzük, miszerint vízzel kezdjük, és acetonitrilt adva hozzá, annak koncentrációját az elu- 15 álószerben 70%-ig növeljük. Ilyen módon 64 mg, 200 ‘C feletti olvadáspontú (la,2ß,3oe)-5-amino-3-[2,3- bisz(hidroxi-metü)-ciklobutü]-3,6-dihidro-7H-l,2,3 -triazolo[4,5-d]pirimidin-7 -ont kapunk.

A termék elementáranalízise a 20 C[ 0H14N603x2,5H20 összetételnek felel meg.

Számított: C: 38,57, H: 6,15, N: 26,99%,

talált: C: 39,17, H: 4,98, N: 26,51%.

9. példa 26

Vírusos fertőzés kezelése in vitro sejttenyészetben A vegyületek hatékonyságát, vagyis hogy többféle vírusos fertőzést képesek kivédeni, úgynevezett vírustitrálással állapítottuk meg. A vírustitrálás kivitelezése az alábbiak szerint történik, a kapott eredményeket 30 az 1. táblázat tartalmazza.

Rövidítések:

HSV-1- herpesz szimplex vírus, típus: 1, törzs: Schooler

HSV-2- herpesz szimplex vírus, típus: 2, törzs: 35 1986

VZV- varicella-herpesz zoster vírus, törzs: ELLEN HCMV- emberi citomegalovírus, törzs AD 169 MuLV- egérleukémia vírus, törzs CAS Plakkszámlálás: 40

Egy 6 tálkás tenyésztőtálca (Costar, Cambridge,

MA) tálkáiban egyenletes rétegben tenyésztett WI-3 8 sejteket megfertőzünk HSV-1, HSV-2, HCMV és VZV vírusszuszpenziókkal, majd 1 óra múlva a vizsgálandó anyag kétszeres hígításainak sorozatát tartalmazó táptalajt juttatunk a sejtrétegekre. 37 *C-on inkubáljuk a tenyészeteket, majd HSV-1 és HSV-2 esetén 4 nap elteltével, HCMV és VZV esetén 6-7 nap múlva megszámoljuk a rögzített és megfestett sejtmezőben a keletkezett plakkok számát, illetve kiértékeljük a gátló hatást. Az ID50 értékeket azokból a koncentrációkból számítjuk, amelyek a kontrolihoz képest legalább 50%-kal csökkentették a plakkok számát.

Egérleukémia vírussal a meghatározást némi módosítással, Row és munkatásai, valamint Shannon és munkatársai által leírt módon végezzük. Egy 6 tálkás tenyésztőtálca minden egyes tálkájában hozzávetőlegesen 2xl05 számú SC-1 sejtet helyezünk el. Éjszakán át inkubáljuk a sejteket, majd DEAE-dextrán hozzáadásával, és további 1 órán át 37 ‘C-on történő inkubálással aktiváljuk a tenyészeteket. Ezt követően a tenyészeteket leöblítjük és MuLV szuszpenzióval beoltjuk, majd a vizsgálandó anyagot különböző koncentrációban tartalmazó tápfolyadékot helyezünkrá. 3 napon át 37 *C-on folytatott inkubálás után a tápfolyadékot frissre cseréljük, amely ugyancsak tartalmazza a vizsgálandó anyagot, és még 3 napon át 37 ‘C-on folytatjuk az inkubálást. Ezuátn a tenyészeteket a tápfolyadék eltávolítása végett kimossuk, ultraibolya fénnyel besugározzuk, és hozzávetőlegesen 5xl03 XC sejtet, valamint a vizsgálandó anyagot megfelelő koncentrációban tartalmazó tápfolyadékot helyezünk a tálkába. Újabb 4 napon át inkubáljuk a tenyészeteket, miközben azXC sejtek telepítését követő második napon a vizsgálandó anyagot is tartalmazó tápfolyadékot frissre cseréljük. Végül a sejttenyészeteket leöblítjük, megfestjük, és a sejtmezőben képződött plakkokat megszámoljuk.

Irodalmi hivatkozások:

W. P. Rowe, W. E. Pugh, és J. W. Hartley: Plaque Assay Techniques for Murine Leukemia Viruses, Virology, 42:1136-1139 (1970); W. M. Shannon, R. W. Brockan, L. Westbrook, S. Suaddix és F. M. Shabel: Inhibition of Gross Leukemia Virus-Induced Plaque Formation in XC Cells by 3-Deazauridine, J. Natl. Cancer Inst., 52:199-205 (1974).

1. táblázat

ID50 (pmol) értékek az alábbi vírusokra

R

1

HSV-1

HSV-2

V2V

HCMV

MuLV

C

CD

1

0,04-V

Oj 08

0,2

w

CD

3j8

0

1

0,8 -8 j O

00

O

2;0

°18

n. a

13