203675. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alegység-vakcina előállítására a sertések Aujeszky-féle betegsége ellen
1 HU 203 675 B 2 Az állást követően a folyadékban pelyhes, fehér csapadékképződött. Ezt követően a képződött csapadékot 5000 fordyperc centrifugálissal 10 perc kezelési idő alatt kiülepítettük. Az elkülönített tiszta felülúszóhoz második lépésben további polietUénglikol 60ÖÖ-et adagoltunk, ameddig annak koncentrációja 8 tömegszázalékot elérte. Az elegyet egy éjszakán (kb. 16 órán) át +4 °C hőmérsékletű hűtőszekrényben állni hagytuk. Az állást követően a folyadékban pelyhes, fehér csapadék képződött, amely tartalmazta a kinyerendő protektiv glikoproteineket. Ezt követően a képződött csapadékot 5000 fordyperc sebességű, 10 perc idejű centrifugálással ki - ülepítettük. A glikoprotein tartalmú csapadékot 10 ml mennyiségű, 8 tömegszázalék polietUénglikol 6000-et tartalmazó foszfátpufferes sóoldatban (pH-7,4) rövid ultrahangos kezeléssel eloszlattuk, majd 10 perc ideig 5000 fordypercen centrifugáltuk. Az így kapott csapadék kimutatható mennyiségű detergenst már nem tartalmazott. A csapadékot foszfátpufferes sóoldatban 100 mikrogramm/ml koncentrációban (amelynek mérése az 1. példában leírtak szerint történt) ultrahangos kezeléssel reszuszpendáltuk, majd azonos mennyiségű komplett Freund-adjuvánssal kevertük, és 500-500 mikrogramm mennyiségben az Aujeszky-féle betegségtől mentes áüományból származó négy sertésbe izomba oltottuk. Három hét elteltével az állatok vérsavója az 1. példában leírtak szerint vizsgálva 1:16 -1:64 hígításban semlegesítette az Aujeszky-féle betegség vírusát. Az immunizáláshoz használt készítmény az 1. példában leírtak szerint vizsgálva maradék élővírust nem tartalmazott és alegység vakcinaként használható. 5. példa Az 1. példában említett Aujeszky-féle betegség vírusát a 4. példában leírt körülmények között Cytodex-1 típusú mikrokarrieren létrehozott PK-15 szövettenyészetben szaporítottuk el. Az így kapott víruspreparátumot a 2. példában leírtakhoz hasonló körülmények között oktilfenü-polietilénglikol-éterrel szolubUizáltuk, majd az oldhatatlan anyagokat belőle alacsony fordulatszámon (2500 fordyperc, 10 perc ideig) végzett centrifugálással eltávolítottuk. Az oldatból a későbbi vizsgálatok céljából 10-10 ml mennyiséget félretettünk és +4 °C hőmérsékleten tároltunk. Az így kapott víruspreparátumot a 3. példában leírtak szerint először 3,5 tömegszázalék polietUénglikol 6000 hozzáadásával állni hagytuk. Az elegy centrifugálásával (2500 fordyperc, 10 perc) kapott csapadék az 1. példában leírt eUenáramú immunelektroforézissel vizsgálva az Aujeszky-féle betegség vírusára nézve specifikus glikoproteineket nem tartalmazott, ezért a csapadékot a felülúszótól elkülönítettük. A felülúszóból a glikoproteineket a polietUénglikol koncentrációjának 8 tömegszázalékra való emelésével csaptuk ki. Ennél a koncentrációnál a 3. példánál leírtakhoz hasonlóan a glikoproteinek maradéktalanul kicsapódtak, míg a detergens és a lipidek a felülúszóban maradtak. A 2500 fordyperc sebességgel 10 perc alatt lecentrifugált csapadékot ultrahangos kezeléssel a 3. példában leírtak szerint először 8 tömegszázalék polietilénglikolt tartalmazó foszfátpufferes sóoldattal, majd két ízben ugyanolyan, de polietüénglikolt nem tartalmazó foszfátpufferes sóoldattal mostuk. A mosási lépések a mosófolyadékban történő reszuszpendálást, majd a csapadék centrifugálásos ülepítését tartalmazzák. A 8 tömegszázalék polietUénglikolt tartalmazó foszfátpufferes mosás a csapadékban maradt lipidek és Triton X100 teljes eltávolítását segítette elő. Enélkül ugyanis a további mosás során glikoprotein veszteség jelentkezne. Ilyen körülmények között az 1. példában leírtak szerint végzett ellenáramú immunelektroforézises vizsgálattal számottevő glikoprotein veszteséget nem tapasztaltunk, ugyanakkor a preparátumot az egyéb szennyező fehérjéktől meg lehetett szabadítani. Acsapadékbanlevőglikoproteineket 1 tömegszázalék oktUfenil-polietilénglikol-étert (Triton X100-at) tartalmazó foszfátpufferes sóoldattal szobahőmérsékleten, néhány percig tartó rázás közben feloldottuk, az oldhatatlan csapadékot 5000 fordyperc fordulatszámon 10 percen át végzett centrifugálással eltávolítottuk. A Triton X100-zal való kezelés a glikoproteineket ismét oldatba vitte, és a folyadékban maradt csapadék eltávolításával további tisztítást értünk el. Az így kapott tiszta oldat eUenáramú immunelektroforézissal az 1. példában leírtak szerint vizsgálva 1:8 hígításban pozitívan reagált. A glikoprotein-preparátumból a detergenst az 1. példában leírtak szerint, tehát AMBERLITE-es kezeléssel, távolítottuk el. A preparátum tisztaságának nagy érzékenységű vizsgálatához az 1. példában leírt módon előállított nukleokapszid-fehérjéket radioaktív jód izotóppal jelöltük (Salacinski, P. R. P. et al.: Anal. Biochem. 1981. 117,136.), a vírusnuldeinsav jelölése pedig triciált timidinnel történt (Ben-Porat, T. and Kaplan, S: J. of Virology, Nov. 1984,583-590). Itt két igazolási eljárásról van szó. Mindkét esetben a Tritonnal kezelt közbenső termékből félretett mintához adtuk hozzá a jelölt anyagot, és a további eljárási lépések végrehajtása után a végtermékben vizsgáltuk a jelölt anyag jelenlétét, amely mindig negatív eredményt adott, azaz benne radioaktivitást nem lehetett kimutatni. Ez a módszer a vírus-DNS és a belső nukleokapszid-fehérjék teljes eltávolítását igazolta. A 2. példában leírtak szerint végzett vírussemlegesítés-gátlási próbával vizsgálva a preparátum 1:8 hígításban reagált. A készítmény 1-1 ml mennyiségét azonos térfogatú inkomplett Freund adjuvánssal (Humán Oltóanyagtermelő és Kutató Intézet, Budapest) emulgeáltuk, majd az 1. példában leírtak szerint hat, egyenként kb. 30 kg testtömegű sertésbe oltottuk izomba. Az 6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
