203675. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alegység-vakcina előállítására a sertések Aujeszky-féle betegsége ellen
1 HU 203 675 B 2 oltást 3 hét elteltével adjuváns nélkül hasonló antigénmennyiséggel megismételtük, majd újabb 2 hét múlva az 1. példában említett mikromódszerrel megvizsgáltuk a vérsavók vírussemlegesítő ellenanyag-tartalmát. Az állatok vérsavója 1:256 -1:512 titerben pozitív reakciót adott. Az oltóanyag az 1. példában leírtak szerint vizsgálva maradék élővírust nem tartalmazott. . Minthogy a tisztítási eljárás során a preparátumból a lipideket eltávolítottuk, az oltóanyagban a glikoproteinek nagy valószínűséggel fehérje-micella formájában vannak jelen. 6. példa Az 1. példában leírtak szerint termelt víruspreparátumot 1 tömegszázalék CHAPS, azaz zwitterionos (ikerionos) detergens (kolamidopropil-dimetilammonio-propánszulfonát - Jennings, R. et al.: Arch. Virol. 1988,98,137.)hozzáadásával szolubilizáltuk, majd az 5. példában leírt polietüénglikolos frakcionálással tisztítottuk. A CHAPS hozzáadása a Tritont helyettesítette. A végtermék az 1. példában leírt módon vizsgálva vírussemlegesítés-gátlási próbával 1:4, ellenáramú immunelektroforézissal 1:8 titerben reagált. A készítmény poliakrilamid-gélben nátriumlauril-szulfát és merkapto-etanol jelenlétében végzett elektroforézisével ki lehetett mutatni a vírusenvelop glikoproteinjeit (Hampl, H. et al.: J. Virol. 1984,52,583). 7. példa Az 5. példában leírtak szerinti lépések alkalmazásával 1 tömegszázalék oktüfenü-polietilénglikol-éteres (TritonXIOO) foszfátpufferes sóoldatban oldottglikoprotein frakciót állítottunk elő, amelyből a csapadékot eltávolítottuk és a kapott oldat fehérjetartalmát az 1. példában leírt módszerrel mérve 3,2 mg/ml értéket kaptunk. A mosott glikoprotein frakcióhoz 5 ml metanolos lipid oldatot adtunk, amely 0,5 g össz-lipid/ml koncentrációval rendelkezett. Az oldatban a lipid keverék formájában volt jelen, amelyet egyrészt tojáslecitin (egg yolk phosphatidylcholin, gyártó: Serva Feinbiochemica, Heidelberg), másrészt pedig koleszterin (Reanal Finomvegyszergyár, Budapest) 7:3 arányban képezett. Az elegyet az 1. példában leírt módon Amberlite kezeléssel detergens-mentesítettük. A glikoprotein preparátum lipid jelenlétében végzett detergens-mentesítése liposzómák (jelen esetben viroszómák) kialakulását eredményezi, amelyek az eredeti vírusenvelophoz hasonló orientációjú inzertált glikoproteineket tartalmaznak. Az oltóanyag biztonsági és in vitro hatékonysági vizsgálatait az előző példák szerint végeztük. A preparátum 1-1 ml-es mennyiségeit azonos térfogatú komplett Freund-adjuvánssal keverve hat sertésbe oltottuk, majd az oltást 3 hét elteltével megismételtük. Az esetleges vadvírusos fertőződés kontrollálására a kísérlet teljes időszakában a mentes állományból származó három további sertést az immunizált állatokkal együtt tartottunk. A 2. oltástól számított 10. napon valamennyi sertést intranazálisan fertőztünk az általunk izolált vadvírus törzs (lásd az 1. példát) 1 X 105 TCID50 mennyiségével. Az oltatlan kontroll állatok a ráfertőzést követően megbetegedtek, 41 °C feletti lázat, étvágytalanságot, bágyadtságot, hányást, testsúlycsökkenést és több napig tartó, magas titerű vírusürítést tapasztaltunk. Ezzel szemben az immunizált állatokon az Aujeszky-féle betegség semmiféle jele sem mutatkozott, súlygyarapodásuk töretlen maradt, és a vírust közülük mindössze egyetlen egyed ürítette, az is csak egy napig és minimális mennyiségben (1 sertés ID50; 50%-os sertésfertőző adag). Az 1 ID50-es mennyiség az a vírusmennyiség, amellyel fertőzve a kísérleti állatcsoport fele betegszik meg. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás Aujeszky-féle betegség elleni alegységvakcina hatóanyagának előállítására az Aujeszky-féle betegség vírusából vagy annak protektiv antigénjéből előállított szaporított vagy tenyésztett állománynak nemionos vagy zwitterionos detergenssel történő szolubüizálása, a vírus nuldeokapszid eltávolítása, az antigént tartalmazó vírus glikoproteinek elkülönítése és a detergens eltávolítása útján, azzal jellemezve, hogy a detergenssel szolubüizált oldathoz 4000-8000 dalton móltömegű polietilénglikolt adagolunk az oldatra vonatkoztatott 2-5 tömegszázalék mennyiségben, hidegen állni hagyjuk, a keletkezett csapadékot a csapadékképződés befejeződését követően eltávolítjuk, majd a felülúszóhoz további polietilénglikolt adagolunk 7-10 tömegszázalék koncentráció eléréséig, hidegen állni hagyjuk, a keletkezett csapadékot a csapadékképződés befejeződését követően elkülönítjük, adott esetben mossuk, majd a protektiv antigéneket tartalmazó csapadékot pH 6-8 puffer oldatban reszuszpendáljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5500-6500, előnyösen 6000 dalton móltömegű polietilénglikolt használunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ózza/ jellemezve, hogy a polietilénglikol adagolása után az oldatot mindkét esetben +2 °C és +8 #C hőmérsékleten, 10-20 óráig állni hagyjuk. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polietüénglikol adagolását követően keletkezett csapadékot mindkét esetben 2000-3000 ford ./perc fordulatszámon végzett centrifugálással különítjük el. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második polietilénglikol adagolást követően elkülönített csapadékot 5-10 tömegszázalék mennyiségű polietflénglikolt tartalmazó pH 6- 8 foszfátpufferes sóoldatban ultrahangos keverés közben mossuk, majd a csapadékot 2000-3000 fordYperc fordulatszámon végzett centrifugálással különítjük el. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mosásból és a csapadék azt követő elkülönítéséből álló lépéseket több alkalommal megismételjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
