203675. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alegység-vakcina előállítására a sertések Aujeszky-féle betegsége ellen

1 Hü 203 675 B 2 Az elkülönített felülúszóból a vírus-nukleokapszi­­dot az 1. példában leírtak szerint 20%-os szacharóz párnán végzett ultracentrifugálással ülepítettük ki. Eddig a szakaszig eljárásunk lényegében a Maes és Schutz által javasolt (Maes, R. K. and Schutz, J. G: Am. J. Vet. Rés. 1983,44,123.) alegység vakcina ké­szítési módszernekfelelt meg. Aglikoproteineket tartalmazó leszívott felülúszó az 1. példában említett ellenáramú immunelektroforézi­­ses módszerrel vizsgálva 1:8 hígításban pozitív ered­ményt adott. A felülúszót az 1. példában leírt módon semleges sztiroldivinil-benzol-kopolimer adszorbens gyantával (kereskedelmi néven: Amberlite XAD-4, a Rohm and Haas, Philadelphia, Pennsylvania terméke) mentesí­tettük a detergenstől. A glikoprotein-frakció specifi­kus antigéntartalmát vírussemlegesítés-gátlási próbá­val vizsgáltuk. Az antigénpreparátumból tápfolyadék­ban kettes léptékű hígításokat (2,4,8,...) készítettünk. A próbában ellenanyagként az 1. példában ismertetet­tek szerint nyert, 1:1024 vírussemlegesítő titerű sertés vérsavó négy neutralizáló egység ellenanyagot tartal­mazó 1:256-os hígítását használtuk. Az azonos térfo­gatban vett savó és antigén hígításokat összekeverés után 37 °C-on 1 órát inkubáltuk termosztátban, majd 10 percig2500 fordiperc fordulatszámon centrifugál­tuk. Az elkülönített felülűszó maradék ellenanyag­tartalmát 100 TdD50 (50%-os szövettenyészet-káro­­sító adag) Aujeszky-féle betegség vírusa hozzáadását követő újabb 1 órás, 37 °C hőmérsékleten végzett in­­dubálás után szövettenyészetre való oltással vizsgál­tuk az 1. példában leírt mikromódszer segítségével. A vizsgált preparátum 1:4 hígításig gátolta a próbában alkalmazott ellenanyag mennyiség vírussemlegesítő hatását. Az 1. példában leírt eljárásokkal vizsgálva a készít­mény maradék élővírust nem tartalmazott. Az izomba oltott nyulak vérsavója az (egyszeri) oltást követően három héttel az Aujeszky-féle betegség vírusát (az 1. példában leírt mikromódszerrel vizsgálva) 1:8-1:16 hígításban semlegesítette. 3 3. példa A Phylaxia Állatgyógyászati Oltóanyagtermelő Vállalat, Budapest által termelt, a kereskedelemben forgalmazott Aujeszky-féle betegség elleni élővírusos vakcinából származó Bartha K/61 törzset PK-15 sejt­tenyészetben mikrokarrieren (Pharmacia Fine Che­micals AB, Uppsala) szaporítottuk. Az így kapott törzs gl glikoproteint nem tartalmaz, miután nukleinsavá­­ból az ezt a fehérjét kódoló génszakasz hiányzik. En­nek a törzsnek a használata a gl-en alapuló differenci­áldiagnosztikai módszer alkalmazására is lehetőséget teremt. A további eljárási lépések megegyeztek a 2. példá­ban leírtakkal, és ezek eredményeként glikoprotein preparátumot kaptunk. A preparátum antigéntartal­mát az 1. példában leírtak szerint termelt immunsavó­nak négy neutralizáló egységet tartalmazó hígításával vírusneutralizáció-gátlási próbával vizsgáltuk. A pre­parátum 1:8 hígításban gátolta a savó vírussemlegesítő hatását, ami igazolja a protektivitásért felelős anti­géntartalmát. Az 1. példában leírtak szerint végzett maradék fer­tőzőképesség meghatározás negatív eredményre veze­tett, az oltott nyulak vérsavója két héttel az (egyszeri) oltást követően 1:16 -1:32 titerben semlegesítette az Aujeszky-féle betegség vírusát. Ezt a tényt az 1. példá­ban hivatkozott mikromódszerrel állapítottuk meg. 4. példa A 2. példában leírtak szerint jártunk el a detergens kezelést követő alacsony fordulatszámú centrifugálá­­sig, és kapott, centrifugált folyadékból mintákat vet­tünk és ezekhez rendre az oldat végkoncentrációjára vonatkoztatott 1,2,3,4,5,6,7,8,9 és tömegszázalék 6000 dalton molekulatömegű polietilénglikolt (keres­kedelmi nevén Karbowax 6000, forgalmazza a Reanal Finomvegyszergyár, Budapest) adtunk, majd az ele­­gyeket egy éjszakán (kb. 16 órán) át +4 °C hőmérsékle­tű hűtőszekrényben állni hagytuk. Az állást követően a folyadékban pelyhes, fehér csapadék képződött, amelynek mennyisége a polietüénglikol mennyiségé­vel arányosan nőtt. Ezt követően a képződött csapadékot 5000 ford ./perc fordulatszámon 10 percen át végzett centri­­fugálással kiülepítettük. Feltételeztük, hogy a polieti­­lénglikol adott koncentráció felett kicsapja a vírusfe­hérjéket, ezen belül a protektiv glikoproteineket is. Az elkülönített felülúszó glikoprotein tartalmát az 1. és 2. példákban leírtak szerint ellenáramú immun­­elektroforézissel, illetve vírussemlegesítés-gátlási próbával vizsgáltuk. Amikor a polietüénglikol kon­centráció 4% alatt volt, glikoprotein kicsapódást nem tapasztaltunk. Ilyen koncentrációnál azonban a csapa­dék jelentős mennyiségű egyéb szennyező fehérjét (nagy molekulatömegű sejt- és vírusfehérjék) tartal­mazott. A glikoprotein-detergens micellák a 4% feletti poli­etüénglikol hatására disszociálnak, és belőlük a gliko­protein szelektíven kicsapódik. Ezt bizonyítja az is, hogy a csapadékban lévő glikoproteineket további de­tergens hozzáadása nélkül nem lehet oldatba vinni. A detergens a polietilénglikolhoz hasonló kémiai szerke­zete következtében a polietüénglikolt tartalmazó fe­­lülúszóban marad. Úgy találtuk, hogy 8 tömegszázalék polietüénglikol 6000 maradéktalanul kicsapja a pro­tektiv glikoproteineket. Minthogy a polietüénglikol hidrofób természetű, a hasonló tulajdonságú lipidek is a polietüénglikol fázis­ban maradnak. A 10 mintával készített kísérlet eredménye alapján a glikoproteineket tartalmazó kiindulási felülúszóhoz a nagy molekulatömegű szennyező sejt- és vírusfehér­jéknek az oldatból való eltávolítása céljából első tisztí­tási lépésként az oldat végkoncentrációjára számított 3,5 tömegszázalék polietüénglikol 6000 anyagot ada­goltunk, majd az elegyet egy éjszakán (kb. 16 órán) át +4°C hőmérsékletű hűtőszekrényben állni hagytuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6

Next

/
Thumbnails
Contents