203673. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vakcina előállítására baromfifélék e. coli baktériumvérűség elleni védelmére
1 Hü 203 673 B 2 korától, testtömegétől, a védelem kívánt időtartamától, az adagolás módjától, valamint attól függ, hogy aktív vagy passzív immunizálást kívánunk-e elérni. A hatóanyag mennyisége a vakcinában parenterális adagolás esetén mintegy 10-100 pg. Az ismertetett aktív immunizálást elsősorban egészséges madarak védelmére alkalmazzuk. Természetes azonban, hogy FII fimbriát tartalmazó £. colival fertőzött madarak is kezelhetők az Fl 1 fimbria vagy annak szakaszai vagy aggregátjai ellen ható antitesttel. 1. példa: Az FII fimbria tisztítása A fimbria tisztításához három vad-típusú E. coli törzset tenyésztünk egy éjszakán keresztül véragar alapú (Qxoid) lemezeken 37 °C hőmérsékleten. Ebből a célból az E. coli baktériumvérűségben szenvedő csirkék beteg szívéből izolált CH2 (078X80214), CH4 (02X121-) és CH6 (01X121-) E. coli törzseket alkalmazzuk. Az FII fimbriát tartalmazó AM1727- pPIL291-15klónt(DeReeésmunkatársai idézett műve [1985]) 16 órán keresztül Biostat (Braun) fermentorban „Brain Heart Infusion" tápközegben tenyésztjük, amely 50 pg/ml ampicülint tartalmaz. A tenyésztést 37 *C állandó hőmérsékleten, pH-7,4 értéken és mintegy 40%-os oxigéntelítettség mellett végezzük. A baktériumokat 1D mmól/1 trisz-HCl pufferben (pH-7,5) begyűjtjük. A fimbria elválasztásához a baktériumokat vagy tizenötször egymás után egy percen keresztül jégen Sorval Omnimixer berendezésben kezeljük, vagy 15 percen keresztül 65 #C hőmérsékleten melegítjük, vagy a két említett kezelést kombináljuk. A baktériumokat ezután centrifugálissal és szűréssel eltávolítjuk, a nyers fimbria oldatot koncentráljuk és a fimbriát YM100 szűrővel ellátott Amicon sejten intenzíven mossuk. A fimbriát ezután például Korhonen és munkatársai módszerének (Infect. Immun. 27,586-575 [1980]) módosított változatával tisztítjuk, amelynek során a fimbriát ammónium-szulfáttal kicsapjuk, nátriumdezoxüáttal oldjuk és cukróz gradienssel centrifugáljuk. Az így tisztított fimbria készítmények elektronmikroszkópiáikig azonos fimbriaszerkezetet mutatnak (J. F. Van den Bosch és munkatársai: Infect. Immun. 29,226-233 [1980]). Afimbriakészítmények az SDS-PAGE vizsgálatban (B. Lugtenberg és munkatársai: FEBS Lett. 58, 254-258 [1975]) és a „Western Blotting” vizsgálatban (H. G. Muilerman és munkatársai: Anal. Biochem. 120, 46-51 [1982]) a különböző fimbriák ellen felhozott valamennyi antiszérummal csak egyetlen sávot mutatnak a 18 kD értéknél. 2. példa: Vakcina előállítás A) Fimbriát tartalmazó vakcinát állítunk elő víz-azolajban emulzió formájában ásványi olaj (alacsony viszkozitású paraffin), valamint emulgeátorként poliszorbát 80 és szorbitán-monooleát felhasználásával. B) Az A pontban leírt módon vakcinát állítunk elő, amely 50 pg/ml mennyiségben vad-típusú CH4 (02X1:H-) E. coli törzsből tisztított Fl 1 fimbriát tartalmaz. C) Az A pontban leírt módon vakcinát állítunk elő, amely 50 pg/ml mennyiségben AM1727-pPEL291-15 kiónból tisztított Fl 1 fimbriát tartalmaz. A klón 1-709 szám alatt a Collection Nationale de Cultures de Microorganismes of the Pasteur Institute in Paris gyűjteményben került deponálásra (1987. 10.19.). 3. példa: Aktív immunizálás Az aktív immunizálási kísérletekhez a 2. példában leírt módon vakcinát állítunk elő, ezt intramuszkulárisan a vizsgált madarakba fecskendezzük és a fajlagos anti-fimbria szérum antitest szint kifejlődését ELISA módszerrel vizsgáljuk. A) ELISA vizsgálat A vizsgálathoz PVC mikrotitráló lemezeket egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten inkubálunk. Minden mintahelyhez 100 pl 1. példa szerint előállított tisztított fimbriaoldatot adunk, amely 2,5 pg fimbriát tartalmaz 1 ml 0,04 mól/1 PBS-ben (pH-7,2). Ezután minden mintahelyhez 200 pg 5%-os, PBS-ben felvett BSA oldatot adunk és a lemezeket 20 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubál juk, majd vízzel mossuk és levegőn szárítjuk. Az antifimbria-szérum vizsgálatához minden mintahelyhez pufferben (pH-7,4, -0,2 mól/1 Na2HP04,0,2 mól/1 NaQ, 0,1 tömeg% BSA és 0,05 tömeg% Tween 80) felvett hígítási sorozat 100 pl-es részletét adagoljuk és a lemezeket 1 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubál juk. Mosás után minden mintahelyhez 100 pl hígított konjugátumot (nyúl anticsirke IgG/PO [H+L], Nordic) adunk és a lemezeket 30 percen keresztül inkubáljuk, majd ismét mossuk. Az antitest aktivitást kolorimetriásan határozzuk meg úgy, hogy minden mintahelyhez 100 pl enzimszubsztrátum oldatot adunk (az oldat 15 ml desztUlált vizet, 1,5 ml nátrium-acetát/citromsav pufferben [pH-5,5] felvett 0,14 tömeg%-os karbamid-peroxid oldatot és 0,2 ml dimetil-szulfoxidban felvett 0,6 tömeg%-os TMB oldatot tartalmaz). Az enzimreakció lejátszódásáig a lemezeket sötétben tartjuk, majd a reakciót 10 perc elteltével mintahelyként 50 pl 4 n kénsav adagolásával leállítjuk. Az abszorpciót ezt követően 450 nm-nél (A450) mérjük. Az első szérumhígítás 1:50 volt. A háttér meghatározásához minden lemeznél legalább nyolc mintavételi helyre vakcinálás előtt nyert és 1:50 arányban hígított szérumot adagolunk és mérjük. Az antitest szint jelölésére azt a maximális szérum hígítást adjuk meg, amely legalább 1,15-szörös A450 értéket ad a háttér átlagos A450 értékéhez képest. B) SPF broiler csirkék vakcinálása Hathetes SPF broiler csirkéknek (Gezondheidsdienst voor Pluimvee, Doom, Hollandia) intramuszkuláris injekció formájában 1 ml 2B) példa szerint előállított vakcinát adagolunk. Négy hét elteltével ugyanebből a vakcinából emlékeztető oltást adunk. Az eredményeket a 3. táblázat mutatja, ahol az ELISA vizsgálat eredményeinek logaritmusát adjuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
