203673. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vakcina előállítására baromfifélék e. coli baktériumvérűség elleni védelmére
1 HU 203 673 B 2 ként elsősorban az FII fimbriát tartalmazza, de emellett vagy helyette tartalmazhatja az Fl 1 fimbria immunogén szakaszát is. Ez az immunogén szakasz jelentheti például a 18 kD alegységet, ennek aggregátjait vagy fragmenseit vagy az FII fimbriára jellemző adhezint vagy ennek aggregátjait vagy fragmenseit. A 18 kD alegység vagy az Fl 1 adhezin említett fragmense valamely olyan polipeptid, amely egy vagy több olyan epitopot tartalmaz, amely képes baromfiban stimulálni az Fl 1 típusú E. coli ellen védő antitesteket. A 18 kD alegység vagy az FII adhezin megfelelő polipeptid fragmensei megtalálhatók például a szokásos technikákkal. Ilyet ismertet például T. P. Hopp és K. R. Woods (Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences, Proc. Natl. Acad. Sei. 78, 3824-3828 [1981]), amely szerint az aminosavlánc egymást követő szegmenseinek hidrofilitását határozzák meg. A meghatározás eredményét a 2. ábra mutatja. Az ábrában az Fl 1 alegység hidrofil profilját az ismert aminosavszekvencia alapján adjuk meg. Az ábrázolt profil a hét aminosavként lemért hidrofil jelleg átlagértékét mutatja. Feltehető, hogy a legnagyobb hidrofilitást mutató szakaszok alkotják az antigén determinánst. A 2. ábrában ezeket a szakaszokat fekete négyzetekkel jelöljük, amelyek az alábbi aminosav szegmenseknek felelnek meg: 24-33 Ile-Ser-Gln-Lys-Ser-Ala-Asp-Gln-Ser-Ile 45-57 Ala-Gly-Gly-Thr-Ser-Lys-Pro-Met-Asp- Leu-Asp-He-Glu 67-78 Lys-Gln-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Asn-Gly-Lys-Val-Gln 87-95 Thr-Gly-Gln-Ala-Glu-Glu-Leu-Ala-Thr 123-130 Pro-Leu-Lys-Asp-Gly-Asp-Asn-Val 136-142 Leu-Val-Lys-Lys-Ala-Asn-Gly Feltehető továbbá, hogy az FII fimbria 18 kD alegységének antigén determinánsai is ezekben a szakaszokban találhatók. Hasonló következtetésre jutott I. van Die, W. Hoekstra és H. Bergmans is (Microbiol. Pathogenesis 3,149-154 [1987]), akik az Fl 1 fimbriára ugyanezt a modelt alkalmazták. A 18 kD alegység vagy az FII adhezin megfelelő immunokémiailag aktív polipeptid fragmensei azonosíthatók a WO 84/03506 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt eljárással is, az úgynevezett pep-scan módszerrel, amelynek során egy sor, egymást részlegesen átfedő polipeptidet állítanak elő, amelyek a vizsgált fehérje szekvencia szakaszainak felelnek meg, és vizsgálják ezek reaktivitását az antitestekkel. Az immunogén jelleg növelésére a polipeptid fragmens kívánt esetben hordozóhoz kapcsolható. Az FII fimbria vagy annak immunogén szakaszai előállíthatok úgy, hogy a vad-típusú E. coli törzsből ismert módon Fl 1 típusú fimbriát vagy annak származékát izoláljuk és az immunogén szakaszt kívánt esetben elválasztjuk. Az FII fimbria vagy annak immunogén szakaszai előállíthatók úgy is, hogy az FII fimbria vagy annak immunogén szakaszainak előállítását és adott esetben elválasztását kódoló genetikai anyagot tartalmazó rekombináns DNS-sel transzformált sejtből indulunk ki. Lehetséges továbbá az is, elsősorban kisebb polipeptid fragmensek esetén, hogy a teljes fragmenst szintetikusan állítjuk elő, például Merrifield módszerével, amelynek során szilárd fázist alkalmazunk. Ha a hatóanyag előállításához olyan organizmust használunk, amelyben jelen van az FII fimbria vagy immunogén szakaszának előállítását és/vagy kiválasztását kódoló genetikai anyag, akkor előnyösen nem kórokozó organizmust alkalmazunk. Ezek az organizmusok vagy képesek az adott antigén anyag termelésére, vagy olyan rekombináns polinukleotidot tartalmaznak, amely a kívánt antigén anyagot kódolja. Rekombináns organizmusokként alkalmazhatók többek között vírusok vagy baktériumok. Ezek a rekombináns organizmusok önmagukban képesek lehetnek a kívánt antigén anyag termelésére és adott esetben kiválasztására. A találmány szerint előállított vakcinát előnyösem parenterálisan, például szubkután vagy intramuszkulárisan adagoljuk. A fenti adagolással elérhető a vakcináit madarak aktív immunizálása, vagy tojómadaraknak adagolva az utódok passzív immunizálása. Tojómadarak immunizálása esetén a bennük fejlődő antitestek bekerülnek a kialakuló tojások sárgájába és onnan a kikelt csibékbe. A találmány szerint előállított vakcina adagolható továbbá orálisan, intranazálisan, vagy aeroszol inhalálásával. A vakcina találmány szerinti előállításához először a fehérjéről vagy annak polipeptid származékáról vagy az Fl 1 fimbria előállításáról, illetve az Fl 1 fimbriát, a fehérjét vagy a polipeptidet tartalmazó mikroorganizmusról kell gondoskodni. Az utóbbi esetben a fimbriát előnyösen E. coliból nyerjük. Általában az Fl 1 fimbriát tartalmazó E. coli tenyésztése után ez utóbbit például mechanikai leválasztással (nyírás) és/vagy melegítéssel elválasztjuk a baktériumtól, majd a sejteket (például centrifugálással) és/vagy (ultra)-szűréssel eltávolítjuk. Ezután a fimbria tovább tisztítható, amelynek során a tápközegből és/vagy a baktérium membránból származó szennyeződéseket például ultraszűréssel, oszlopkromatográfiásan vagy fajlagos kicsapással (ammóniumszulfáttal vagy más só segítségével, vagy a pH-nak a fimbria izoelektromos pontjára történő beállításával) eltávolítjuk. Parenterális vakcináláshoz a hatóanyag általában vizes oldat vagy szuszpenzió formájában található, kívánt esetben más komponensekkel együtt, amelyek növelik az aktivitást vagy a tárolási időt. Ilyen komponens lehet só, formalin, pH beállító puffer, emulgeátor vagy az immunválaszt javító adalékanyag. Az adalékanyag lehet például ásványi olaj, muramil-dipeptid, alumínium-hidroxid, szaponin, polianion és amfipatikus anyag. A vakcina vagy az adagolásra alkalmas készítmény konkrét összetétele a kezelni kívánt madár fajtájától, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
