203673. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vakcina előállítására baromfifélék e. coli baktériumvérűség elleni védelmére
1 HU 203 673 B 2 A találmány tárgya eljárás vakcina előállítására baromfifélék E. coli baktériumvérűség elleni védelmére. Az E. coli baktériumvérűség vagy E. coli fertőzés olyan betegség, amely gyakran jelentkezik baromfiféléknél (így csirkéknél és pulykáknál) és amely jelentős veszteségeket okoz. A fenti betegségben szenvedő madarak jellemző szimptómái a légzsákgyulladás, a szívburokgyulladás és a máj körüli gyulladás. A kutatások kimutatták, hogy a beteg madarakban lévő E. coli törzsek több mint fele a következő három szerotípus egyikéhez tartozik: 01X1,02X1 vagy 078X80. Az Egyesült Államokban gyakran jelentkezik még a 035 szerotípus is. Feltehető, hogy az E. coli baktériumvérűség egy másodlagos fertőzés, amely a sérült légutakon keresztül, például légúti megbetegedéseket okozó vírusok vagy mikoplazmák által megtámadott légutakon keresztül kerül be a szervezetbe. Keveset tudunk azokról a fertőzőképességet befolyásoló faktorokról, amelyek szerepet játszanak az E. coli fertőzés lefolyásában. Emlősök fertőzése esetén azE. coli törzsek fertőzőképessége érinti például a lekötőfimbriákat, a toxinokat és a vaskiválasztási mechanizmust. Több különböző lekötőfimbriát írtak le, amelyek általában erősen gazdaspecifikusak. így hasmenéses betegeknél kimutatható a CFA fimbria, hasmenéses malacoknál a K88 fimbria, hasmenéses juhoknál, borjaknál és malacoknál a K99 fimbria és a vizeletvezető rendszer fertőzésében szenvedő betegeknél a P fimbria (beleértve az FII típust is). Kimutatták továbbá, hogy az adott típusú lekötőfimbria tisztított formában vakcinaként történő adagolásával az adott állattípusban védekező immunreakció váltható ki (161095, 170 496 és 249739 számú európai szabadalmi leírás és WO 86/04604 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés). Hasonló virulens faktort azonban baromfifélék E. coli baktériumvérűségével kapcsolatban nem azonosítottak. Baromfifélék E. coli baktériumvérűség elleni védelmére olyan vakcinát dolgoztunk ki, amely Fl 1 típusú fimbriát vagy annak immunogén szakaszát tartalmazza. Ez közelebbről azt jelenti, hogy E. coli baktériumvérűségben szenvedő csirkék beteg szívéből olyan E. coli törzsek izolálhatok, amelyek az embereknél a vizeletelvezető rendszer fertőzését okozó E. coli törzsekben előforduló‘FII típusú fimbriákkal azonos fimbriákat termelnek. SzerológiaUag kimutatható, hogy az E. coli baktériumvérűségben szenvedő madarak legnagyobb többségében a fertőzést FII típusú fimbriákat tartalmazó E. coli törzsek okozzák. Ezek a fimbriák olyan fehérjealegységet tartalmaznak, amelynek látszólagos móltömege SDS-PAGE vizsgálat szerint 18,0kD. Ezek előállíthatók vad-típusú madár E. coli törzsek szüárd agar táptalajon 37 °C hőmérsékleten történő tenyésztésével, de nem mutathatók ki, ha az E. colit tápközegben tenyésztjük. A 18 kD fimbria optimális kifejeződése akkor érhető el, ha a baktériumot véragar (bázis) lemezen (például Oxoid lemezen) tenyésztjük. Alkalmas tápközeg továbbá a „penassay” agar lemez (Difco lemez). Nem képződik 18 kD fimbria, ha a tenyésztést 20 °C hőmérsékleten végezzük. FII fimbriát már klónoztak vad-típusú uropatogén E. coli törzsből (J. M. de Ree és munkatársai: FEMS Microbiology Lett. 29,91-97 [1985]). A fimbriamentes K12 E. coli AM1727 törzset pPEL 291-15 plazmiddal transzformálták, amely tartalmazza az FII fimbriát kódoló géneket, és a transzformált törzs képes az FII fimbria termelésére. Ezt az FII fimbriát összehasonlítottuk a 02X1 :H-szerotípushoz és madaraknál gyakran jelentkező CH4 E. coli törzsből tisztított 18 kD fimbriával. Ennek során a következő paramétereket vizsgáltuk: a) morfológia: Elektronmikroszkóp alatt az Fl 1 és a 18 kD fimbria azonosnak tűnik: a fimbria mindkét esetben mintegy 1 pjn hosszú és átmérője mintegy 7nm. b) móltömeg: SDS-PAGE vizsgálat szerint mind az FII, mind a 18 kD fimbria alegységének látszólagos móltömege 18 kD. c) immunkémiai fajlagosság: ELISA-ban az Fl 1 és a 18 kD fimbria azonosan reagál az anti-Fll monoklón antitesttel (J. M. de Ree és munkatársai: J. Clin. Microbiol. 24,121-125 [1986]) és nem ad reakciót az FIA, F1C, F7, F72, F8, F9, F12 vagy F13 típusú fimbriák monoklón antitestével. ú) aminosav összetétel: A 18 kD alegység aminosav összetétele lényegében azonos az Fl 1 alegység öszszetételével (I. van Die és munkatársai: Proteincarbohydrate interactions in biological systems, Academic press, London, pages 39-46, [1886]) (lásd az 1. táblázatot). 1. táblázat Aminosav FII1 18 kD2 Asx 18 18,6 Thr 14 15,3 Ser 12 11,0 Glx 17 16,5 Gly 20 19,6 Alá 19 20,2 Val 13 12,2 Be 6 5,8 Leu 10 10,3 Tyr 3 2,2 Phe 8 7,7 Lys 11 10,1 Arg 0 0,9 His 1 1,4 6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
