203661. lajstromszámú szabadalom • Eljárás diabetes mellitus kezelésére alkalmas, a vérglükóz szintet csökkentő, hatóanyagként telítetlen zsírsavakat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 661 B 2 zsírsavakat. A karbamidos kezelés során a karbamidot olyan poláros, szerves oldószerhez adjuk, mely teljesen oldja a karbamidot és a zsírsavakat egyaránt. Ilyen megfelelő oldószer például a metanol, etanol, izopropanol, petroléter, benzol, triklór-etilén és metü-izobutil-keton. Előnyösen etanolt alkalmazunk, mivel ilyen esetekben nem lép fel toxicitási probléma. A karbamidot az oldószerben oldjuk, kívánt esetben melegítés közben, és így olyan karbamid-oldatot kapunk, melynek karbamid-tartalma általában 10-20%. Ezután a karbamid-oldatot és a zsírsav elegyet elegyítjük. Bár magát a zsírsav elegyet is adhatjuk a karbamid-oldathoz, előnyösen úgy járunk el, hogy a zsírsav elegyet először egy másik szerves oldószerben oldjuk, mivel ez a módszer bizonyos mértékben védi a zsírsavakat a karbamid-oldat magas hőmérsékletével szemben. A szabad zsírsavak petroléterben vagy más, poláros oldószerben, például acetonban, etanolban vagy metanolban oldhatók. A karbamid-oldatot 1 tömegrész zsírsav elegyre vonatkoztatva legalább 0,5 tömegrész, előnyösen 1-4 tömegrész mennyiségben alkalmazzuk. A karbamid-oldatot a zsírsav eleggyel homogén elegy nyeréséig elkeverjük. Ezután a karbamidot kicsapjuk, előnyösen a karbamiddal kezelt oldat hűtésével. Ennek során a telített és mono-telítetlen zsírsavak a karbamid kristályokkal komplexet alkotnak és kiválnak. A hűtést például úgy végezhetjük, hogy az oldatot kívánt esetben hosszabb ideig állni hagyjuk. Ugyanakkor, az oldat mechanikus úton is hűthető, például vízfürdő alkalmazásával. Jó eredményeket érhetünk el, ha az oldatot legalább 50 °C, előnyösen 30-40 °C hőmérsékletre hűtjük. A karbamid még teljesebb eltávolítására az oldat hűtőszekrényben egészen -10 °C hőmérsékletig is hűthető. A telített és mono-telítetlen zsírsavak és karbamid által alkotott komplexet ezután kiszűrjük vagy bármely más módszerrel elválasztjuk. A szűrletet ezután bepároijuk, például bepárlókészülék alkalmazásával, és így az oldószer jelentős részét eltávolítjuk, majd a még visszamaradt karbamidot a zsírsav elegyből 5%os sósav alkalmazásával kimossuk. Az oldószer vízzel történő extrakcióval is eltávolítható, melynek során 1 tömegrész oldószerre 10 tömegrész vizet alkalmazunk. A kapott zsírsav elegy a magasabb fokon telítetlen zsírsavak lényegében tiszta keveréke. Úgy találtuk, hogy ezek az egyes zsírsavak teljesen elválaszthatók igen egyszerű és könnyen végrehajtható módszerrel, melynek során először a zsírsavakat szerves oldószerben, például acetonban oldjuk, majd fokozatosan lehűtjük az oldatot, amíg a kívánt zsírsav az oldatból kiválik. Az oldatnak fokozatos hűtése közben a különböző zsírsavak az oldószerben mutatott különböző oldhatóságuk következtében kicsapódnak. Amint ezek a zsírsavak egyenként kicsapódnak, azokat eltávolítjuk az oldatból. Az oldatban levő koncentrációjuktól függően a különböző zsírsavak különböző ponton csapódnak ki az oldatból. Például úgy találtuk, hogy a DHA 10%-os acetonos oldatból -38 és -40 'C között válik ki. Ugyanakkor az EPA -60 °C hőmérsékleten válik ki. A többi zsírsav legtöbbje -30 °C feletti hőmérsékleten válik ki. Az oldatot fürdőn vagy szárazjég-aceton elegyen hűtjük. A -38 —40 °C hőmérsékleten kiváló csapadékot üvegszűrőn vagy Büchner-tölcséren végzett szűréssel távolítjuk el, anélkül, hogy a hőmérsékletet növelnénk. A kapott kristályok analízise azt mutatja, hogy ez az anyag lényegében tiszta DHA, és az NMR vizsgálatok nem mutatnak cisz-transz konverziót. A -60 °C hőmérsékleten kiváló anyag gyakorlatilag 100%-ban tiszta EPA-nak bizonyul, cisz-transz konverzió nélkül. Az EPA és DHA elválasztása során szükséges igen alacsony hőmérsékletek elkerülésére a felülúszó térfogata minden egyes kristályosítási lépés után csökkenthető, ezáltal a zsírsavak oldhatósága csökken, és a lényegében tiszta DHA és EPA elegye keletkezik. Az alacsony hőmérsékleten végzett, frakcionált kristályosítás során az oldószer-csökkentéssel végzett eljárást a karbamiddal történő kezelési lépés után végezhetjük. Ennek során a karbamidos kezelési lépésben nyert, magasabb fokon telítetlen zsírsavak elegyét ugyanolyan szerves oldószerben oldjuk, melyet a hőmérséklet csökkentésével végzett eljárás során alkalmaztunk, például 10%-os acetonos vagy petroléteres oldatot készítünk. Egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten történő hűtés után a visszamaradt telített zsírsavak és különböző, alacsonyabb fokon telítetlen zsírsavak kiválnak az oldatból. A csapadékot ezután elválasztjuk és elöntjük. Az oldat térfogatát ezután csökkentjük, és ezáltal koncentrációját növeljük. Ezt az oldószer lepárlásával vagy ledesztillálásával végezzük, melynek során az eredeti térfogat előre meghatározott részére csökkentjük a térfogatot, például az eredeti térfogat egyharmadára. Ezután a csökkentett térfogatú oldatot ismét -20 °C hőmérsékletre hűtjük, melynek során új mono-telítetlen zsírsavkristályok jelennek meg, melyeket ismét kiszűrünk. Ezután a szűrlet térfogatát ismét 1/2 - 1/9-ére csökkentjük, és a maradékot egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten hűtjük. Ekkor az oldatból a di-telítetlen zsírsavak válnak ki. Ezeket a kristályokat ismét kiszűrjük és elöntjük. Annak megállapítására, hogy valamennyi nem kívánt zsírsav kikristályosodott az oldatból, a szűrlet tovább hűthető -30 °C hőmérsékletre. Amennyiben nem jelennek meg a kristályok, a tisztítás teljes. Ezután az oldószer lepárolható. A visszamaradt folyadék az EPA és DHA lényegében tiszta keveréke. Kívánt esetben ezek a komponensek is elválaszthatók -38 - -40 °C hőmérsékletre történő hűtéssel, melynek során a DHA válik ki. Diabetes mellhúsban szenvedő betegeket a DHA-t triglicerid-alakban tartalmazó szardíniaolajjal, illetve olyan szardíniaolajjal kezeltünk, melyet előzőleg savhidrolízisnek vetettünk alá, majd a glicerint eltávolítótok. A kísérletet 25 napig végeztük. Minden beteg naponta három teáskanál olajat kapott, és egyébként nem változtatták az étkezési szokásaikat. A kontrollcsoport naponta három teáskanál földimogyoró-olajat kapott. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
