203661. lajstromszámú szabadalom • Eljárás diabetes mellitus kezelésére alkalmas, a vérglükóz szintet csökkentő, hatóanyagként telítetlen zsírsavakat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 661 B 2 nyék között hidrolizáljuk, például lipáz enzim alkalmazásával, majd a nem elszappanosítható anyagot eltávolítjuk szerves oldószerrel végzett mosással, majd a telített és mono-telítetlen zsírsavakat eltávolítjuk oly módon, hogy a telített és mono-telítetlen zsírsavak karbamid-komplexét képezzük, a maradékot szerves oldószerben, előnyösen acetonban oldjuk, lassan lehűtjük, majd a megszilárduló anyagot képződése közben frakcionáltan eltávolítjuk. Egy előnyös megvalósítási változat szerint célszerűen úgy kerüljük el az alacsony hőmérsékletek alkalmazását a tiszta zsírsavak kiválásának teljessé tételére, hogy minden egyes csapadék képződése és eltávolítása után a zsírsav koncentrációját megnöveljük az oldatban, az oldószer egy részének lepárlásával, majd folytatjuk a hűtési lépést. Ily módon gyakorlatilag ugyanolyan kitermelés és tisztaság érhető el, különösen alacsony hőmérsékletek alkalmazása nélkül, mely utóbbi egy nagyobb léptékben végzett eljárásnál nehézségeket okozhatna. Előnyösen az EPA és DHA elválasztásához alkalmazott olaj a lehető legfrissebb, és ily módon az elválasztást a zsírsavak jelentős lebomlása előtt már elvégezhetjük. A találmány szerinti eljárás céljára alkalmas EPA és DHA magas koncentrációját tartalmazó természetes zsírok és olajok például a következők: tengeri állatok zsírjai és olajai, például makréla-, szardínia-, csuka- és heringolaj, csukamájolaj és egyéb tengeri állatok, például gamélarák-jellegű állatok olajai és zsírjai. Megjegyezzük azonban, hogy a találmány szerinti eljárás során bármely forrásból származó EPA és DHA alkalmazható. Előnyös, ha az olaj forrásául szolgáló hal a lehető leghidegebb környezetből származik. A delta-5-deszaturáz enzim, mely az eikoza-tetraénsavnak EPA-vá történő átalakulását katalizálja, optimális aktivitási hőmérséklete 90 #C. Ezért a hideg vizekből származó halak nagyobb mennyiségű EPA-t tartalmaznak, mint a melegvízi halak. Még nagyobb EPA-kitermelés érhető el olyan halakból, melyeket szabályozott környezetben tenyésztettek. Ha a halat gamma-linolénsavban gazdag táplálékon tartjuk, 9 °C hőmérsékletű sós vízben, optimális mennyiségű EPA keletkezik. A természetes zsírt vagy olajat elszappanosítjuk vagy alkoholízisnek vetjük alá a triglicerideknek szabad zsírsavakká vagy zsírsav-észterekké történő átalakítására. Célszerűen olyan módszert alkalmazunk, melynek során nincs jelen erős bázikus reagens, és a reakció hőmérséklete nem magas, mivel ezek peroxidációhoz és cisz-transz átrendeződéshez vezetnek. Az előnyös hidrolízismódszer az enzimes hidrolízis, melynek során lipáz enzimet alkalmazunk 35-40 °C hőmérsékleten és 6-7 pH-értéken. A lipázt szokásos módon císztein vagy aszkorbinsav nyomokkal aktiváljuk. A lipáznak elsza ppanosításra történő alkalmazása azért is előnyös, mivel a lipáz sztereospecifikus, és így nem bontja a transz-zsírsavakat, melyek a természetből a trigliceridekből képződhetnek. így, még ha a kiindulási anyagban jelen is van transz-EPA vagy transz-DHA azt a nem elszappanosított anyaggal együtt eltávolítjuk, és nem lesz jelen a végtermékben. A természetes zsírok és olajok hidrolizálásának egy másik módszere a lipázzal vagy erős bázissal történő részleges hidrolízis. Ha lipázt alkalmazunk, az 1,5- 2 órán át végzett hidrolízis, szemben a szokásos 6 órával, gazdagabb EPA-forrást biztosít, mivel a lipáz előnyösen a kezelt triglicerid első és harmadik elágazását távolítja el. Ismeretes, hogy természetes trigliceridekben a szélső elágazások magasabb fokban telített láncokat tartalmaznak, mint a középső lánc. így a hidrolízis fokának csökkentése automatikusan eltávolítja a telítettebb savak jelentős részét is. Kálium-hidroxid is alkalmazható a természetes zsírok és olajok részleges hidrolízisére. Ilyen esetben az olaj kiindulási anyagot 15-20 perc időtartamig kezeljük a kálium-hidroxiddal, a trigliceridek részleges hidrolizálására. Mint a lipáz esetében, ez a részleges hidrolízis is gazdagabb EPA-forrást biztosít, mivel a triglicerid első és harmadik lánca előnyösebben támadható a bázissal. A részleges hidrolízis után a hidrolízis-elegyhez kénsavat vagy más, erős ásványi savat, például sósavat vagy salétromsavat adunk a zsírsav-elegy elválasztására. A zsírsavak elegye az elegy tetejére úszik, és az alsó, vizes fázist elöntjük. Ez a részleges hidrolízis-lépés arra is alkalmas, hogy más, többszörösen telítetlen vegyületeket eltávolítsunk a trigliceridjeiktől, függetlenül a trigliceridek forrásától. A szabad zsírsavak elegyei természetes forrásuktól elválaszthatók átészterezési eljárással is. A zsírsavat tartalmazó anyagot, például tengeri állatból származó olajat száraz etanollal vagy száraz metanollal, és nyomnyi mennyiségű nátrium-fémmel visszafolyatás közben forraljuk. Ennek során az etil-, illetve metilésztereket nyerjük, ezáltal a szabad zsírsavak megfelelő etil- vagy metü-észtereit felszabadítjuk a triglicerid molekulákból. Ez a módszer lényegesen enyhébb körülményeket igényel, mint a bázikus hidrolízis, és megkíméli a reakcióelegyet az erős körülmények által okozott sötétedéstől. Az észterek az extrakciós eljárás bármely lépésében a szabad zsírsavakká alakíthatók, önmagukban ismert hidrolízis-módszerekkel. Bizonyos esetekben azonban kívánatos lehet közvetlenül az észterek alkalmazása anélkül, hogy azokat a szabad savvá alakítanánk. A következő lépésben a nem elszappanosított anyagokat, például koleszterint, A és D vitaminokat és szénhidrogéneket szerves oldószerrel végzett mosással eltávolítunk. Erre a célra bármely szerves oldószer, például petroléter, metilén-klorid, etil-éter stb. alkalmazható. A szerves fázis elválasztása után a vizes fázist megsavanyítjuk. Erre a célra bármely sav alkalmazható, bár előnyösek a gyógyászatüag elfogadható savak. Ennek során a szabad zsírsavak szerves fázisként elválnak. A vizes fázist elöntjük. Kis mennyiségű nátriumklorid vagy más só hozzáadása jelentősen javítja az elválást. Ezután a zsírsav elegyet karbamiddal kezeljük, és üy módon elváfasztjuk a telített és mono-telítetlen S 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
