203637. lajstromszámú szabadalom • Táptalaj és eljárás rovarírtó nematódák folyékony tenyészetben történő előállítására
1 HU 203 637 B 2 igénye olyan nagy, hogy a módszer ipari kiaknázása gazdasági szempontból nem megfelelő. A 86/01074. számú közzétett PCT találmányi bejelentésben (amelyet Pace et al. néven említünk a továbbiakban) eljárást írnak le nematódák nagy mértékben való előállítására, amely megoldja a levegőztetési körülményekhez kapcsolódó problémák némelyikét. Ennél az eljárásnál meghatározzák azt a kezelési sebességet a kevert reaktorban, amelynél a kifejlett nematódák szétaprózódnak. A keverési sebességet ezután az alá a meghatározott szint alá állítják be és ezen a szinten tartják a tenyésztés időszakában. Pace et al. leírják egy olyan folyékony táptalaj használatát, amely homogenizált marhaveséből és élesztőkivonatból tevődik össze. Más közegek a nematódatenyészetek számára egy szójapepton-élesztőkivonatglükóz készítményt tartalmaznak [Beucher et al. (1971) J. Némától 3:199-200 parazitamentes folyékony tenyészetben való használatra]; továbbá peptonglukóz és baktériumok [Dutky, S. R. et al. (1967) J. Némától 73:140 egygazdás tenyészetre agaron]; valamint tápanyag agar-élesztőldvonat-szójaliszt-kukoricacsíraolaj [Wouts, W. M. et al. (1981) J. Némától 73:467-469, egygazdás szilárd hordozóra vagy habra fdvive]. E táptalajok mindegyike tartalmaz egy vagy több olyan alkotóanyagot, amelynek költséges vagy nehéz az előállítása. A Pace et al. által ismertetett egygazdás folyékony tenyésztési módszer reproduktív sebességet biztosít a 20 nap első 10 napjában (2000-ről 40000-re történő nematóda-szaporodás milliliterenként) és U-k képződnek (fertőző juvenil) a folyékony tenyészetben 20 nap után. Más kutatók olyan parazitamentes rendszereket használnak, amelyek hasonló reproduktív sebességgel rendelkeznek, de nem jelentkeztek jelentős mértékben U-k. Munkánk során felismertük, hogy az egygazdás nematódatenyészet folyékony táptalaj hordozóanyagában egy kritikus komponensnek kell lennie, amely valamely emulgeátor, így tojássárgája, és ez arra szolgál, hogy megkönnyítse a hozzáadott olajok vagy zsírok használatát. Mind ez ideig nem jelent meg semmi - féle közlemény arról, hogy emulgeátort használtak volna entomogén nematódák folyékony tenyészeteinél. Tojássárgáját használtak azonban állati szérumok helyettesítésére emlős parazitáknak a tenyészetében, ahol sikerek és sikertelenségek egyaránt jelentkeztek. A Roder [(1982) Naturwissenschaften 69:92-93] használt tojássárgáját magzati búr júszérum helyettesítésére rovarsejtek tenyésztésénél. M. S. Schnier és B. Fried [(1981) Int. J. Párásítói 10:391-395] tojássárgáját használt NCTC 135-ben Ablosoma suwaense, egy parazita szívóféreg (trematoda, a métely-törzsből) tenyésztésénél. Ezenkívül tojássárgáját gyakran használtak baktérium-sejttenyészetnél, mégpedig Staphylococcus-szal. P. F. Busch et al. [(1973) J. Parasitol 59:319-322] azt találta, hogy a tojássárgája nem megfelelő Cotylurus (egy trematóda) tenyészetéhez, és D. W. W. Kannangara [(1974) Int. J. Parasitol 4:675-6] felismerte, hogy a tojássárgája nem megfelelő Paragonimus tenyésztéséhez. Az említett esetek egyikénél sem szerepelt a tojássárgája valamely olajkomponens emulgeálására. A találmány kidolgozásával az volt a célunk, hogy fokozzuk az entomogén nematódák előállításának a hatásosságát folyékony tenyészetben. A találmány kiterjed egygazdás nematódatenyészet fokozott hatású folyékony táptalaj hordozóanyagára is, amely szabályozza az oxigénigényt. Ez a tápközeg könnyen elkészíthető és viszonylag nem költséges termelést biztosít a jelenleg ismert táptalajokhoz viszonyítva. A találmány magában foglal egy módszert a baktérium- és nematódafejlődés fokozására is, amelynél a keverési sebesség függ az oxigénátvitel változásának a követelményeitől, amely minden egyes nematódafejlődési állapottal kapcsolatban van. A találmány tárgya valamely iparilag nem költséges emulziós táptalaj entomogén nematódáknak folyékony kultúrákban történő tenyésztésére, amelyben a fontos tápanyagokat valamely emulgeátor, így tojássárgája, élesztő-források, előnyösen élesztősejtek, növényi olajok és proteinforrások biztosítanak, és mely a nematódákkal együttélő (szimbiotikus) baktériumokkal van inkubálva. A találmány szerinti táptalaj előnyösen körülbelül 1-2% tojássárgáját, körülbelül 0,1-1% élesztősejtet (száraz tömeg), körülbelül 2-5% kukoricacsíra-olajat és körülbelül 1 -3% szójalisztet foglal magában. A találmány kiterjed egy módszerre is entomogén nematódáknak a fent leírt folyékony táptalajon történő tenyésztésére, amely abban áll, hogy a fenti táptalajt előinkubáljuk az együttélő baktériumokkal, az entomogén tenyészetet ezután felhasználjuk ennek a táptalajnak a beoltására, mimellett a beoltott táptalajt keverjük a nematóda reprodukciójának a ciklusa alatt. A módszer nagy reprodukciós sebességet biztosít és fertőző nematódákat hozlétre 10-16 nap elteltével. A találmány magában foglal egy eljárást entomogén nematódák tenyésztésére viszonylag tiszta, fertőző állapotú nematódák nagy koncentrációban való előállítására valamely fermentáló edényben, amelyben előnyösen elhelyeztük a találmány szerinti táptalajt. Az eljárás során a keverési sebességet az oxigénbevitel kívánalmai szerint változtatjuk annak érdekében, hogy megkülönböztetetten optimális körülményeket biztosítsunk a nematóda-reprodukció és a fejlődés számára. Az 1. ábra a keverési szintek és a nematódareprodukció közötti arányt mutatja, amely az entomogén nematódák fermentációs ciklusa folyamán fennáll. A keverési sebesség állandó, így 50 ford/perc (üres négyzettel jelölve), 125 ford/perc (x'-vel jelölve) vagy 500 ford/perc (csúcsára állított háromszöggel jelölve); vagy változik (+ jelölve) a ciklus folyamán annak érdekében, hogy az oxigénátvitel szintjét 85 x 312 x 102 x Pa-on tartsuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
