203583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriális fertőzések ellen védő emberi monoklonális antitest-készítmények és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203583B rokék-tetrazólium enzimrendszerrel kifejlesztve. Röviden, 1,0 jjJ baktériumot (O.D66=©0,4) cseppentünk nitrocellulóz papírlemez (Schleicher and Schuell, 37 mm nitrocellulóz lemez, behálózott, 0,45 pm) egy hálórészére. Mindegyik lemez kényei- 5 mesen meg tud tartani 60 különböző baktériummintát. A foltokkal telített lemezeket levegőn szárítjuk, 25%-os (térfogat/térfogat) izopropanolban rögzítjük, és 10 percen át blokkoljuk nem zsíros száraz tejpor reagenssel, amint ezt az ELISA módszer- 10 nél leírtuk. A blokkolt lemezeket háromszor öt percig mossuk PBS/Tween 20-ban és átvisszük 35x10 mm-es szövettenyésztő tányérok tetejére. Az antitestet tartalmazó felülúszót (1,0 ml) hozzáadjuk a tetőre és szobahőmérsékleten inkubáljuk 60 percen 15 át. Három 5 perces; PBS/Tween 20-ban végzett mosás után 1 -20 ml 1:1000 arányban PBS-ben hígított, kecske-anti-humán immunglobulinnal konjugált alkálikus foszfatázt (TAGO, Burlingame, Kalifornia) adunk hozzá és 60 percig szobahőmérsékleten 20 tartjuk. A lemezeket a fentiek szerint mossuk és bemerítjük 1-2 ml friss szubsztrátumba, amelyet az alábbi módon készítünk: 16,5 mg bróm-klór-indolüfoszfátot és 8,5 mg nitrokék-tetrazóliumot feloldunk 50 ml alkálikus foszfatáz pufferban (0,1 mól/1 25 trisz-HCl, pH 9,5, 0,1 mól/1 NaCl-lel és 5 mmól/1 MgC12 vel), az oldatot sötétben tartjuk, és közvetle17 nül felhasználás előtt szűrjük. A megfelelő szín-kifejlődés után (10-15 perc) a reakciót elfojtjuk, a lemezt átöblítve többször desztillált vízben. A kifejlesztett lemezeket szárítás után lehet tárolni. A lemezek a következőket tartalmazzák: 50 k: pneumoniae tokos típusú referencia-törzs, amelyet részben Dr. Kenney George-tól (University of Washington, Department of Pathobiology, Seattle, Washington), részben az American Type Culture Collection-tól kaptunk; 4 E. aerogenes klinikai vér izolátum; és 6 E. cloacae vér izolátum (a vér izolátumokat a Harborview Hospital kórháztól /Seattle, Washington/ kaptuk). Az Enterobacter izolátumokat a 23 szabványosított biokémiai vizsgálatot tartalmazó API 20E System rendszert (API Analytical Products, Plainview, New York) alkalmazva tipizáljuk (fajok szerint határozzuk meg). Ez a módszer azonosítja a gram-negatív baktériumok nemzetségét és fajtáját, de a szerotípusát nem. Ezért az Enterobacter baktériumokat — nem úgy, mint az E colit, S. marcescenst és a K. pneumoniae-t — nem azonosítjuk szerotípusként, hanem csak nemzetségként és fajként. Ezekből a kísérletekből a 7D7 antitestről megfigyeljük, hogy további nemzetségek közti kereszt-reaktivitással is rendelkezik. Ez az antitest a következő szerotípusokkal reagál. 18 iK. pneumoniae E.coli S. marcescens E. aerogenes K14.57.60 08,75 012,13,15 Klinikai izolátumok így a 7D7 humán monoklonális antitestről azt észleljük, hogy nemzetségek közti kereszt-reaktivi- 35 tással rendelkezik olyan baktériumokhoz, amelyek az E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes fajokhoz tartoznak, de azE. cloacae-hoz tartozó baktériumokhoz nem. 40 F.A monoklonális antitestek jellemzése Az a felfedezés, hogy a monoklonális antitest kereszt-reakcióa lép számos különböző baktériumnemzetséggel azt sugallja, hogy az antitest egy közös fehérje vagy szénhidrát ellen irányul. Erről a két 45 molekula-fajtáról kimutatták, hogy számításba jönnek a nemzetségek közti kereszt-reakciókban (Mutharia L. és Hancock R.E.W.: „Characterization of Two Surface-Localized Antigenic Sites on Porin Protein F of Pseudomonas aeruginosa” /Két fel- 50 ületen lokalizált antigén hely jellemzése Pseudomonas aeruginosa porin F-fehérjéjén/, Canadian J. of Microbiol. 31,381-386/1985/; és OrskovF. és Orskov L: „Serotypint of Escherichia coli” /Escherichia coli szerotipizálása/, a „Methods in Microbiology” 55 című kiadvány 14. kötetében (szerkesztő: Bergan T„ kiadó: Academic Press, Orlando, Florida/ 43- 112/1984/). A 7D7 által felismert molekulafajták biokémiai jellemzését immunfolt-elemzéssel hajtjuk végre. 60 Röviden, 20 ml egy éjszakán nőtt folyékony tenyészet (az E. coli, S. marcescens és E. aerogenes szerotípusoknál) vagy egy éjszakán át nőtt lemezek (K. pneumoniae-nél) mosott baktériumait 1,0 ml olyan oldattal extraháljuk, amely 64 ml 50 mmól/l-es 65 trisz-t (pH 7,6), 30 ml glicerint, 0,3 g nátrium-dezoxikolátot, 0,14 ml béta-merkapto-etanolt és 6 ml ionmentesített vizet tartalmaz (Schechter I. és Block K. „Solubüization and Purification of trans- Formesyl Pyrophosphate-Slualene Synthetase” /Transz-formezil pirofoszfát-szkvaléhn szintetáz szolubüizálása és tisztítása/, J. Bioi. Chem., 246, 7690-7696 /1971/). 18 órán át 4 "C hőmérsékleten végzett inkubálás után a szuszpenziót 10000 g-nél 10 percen át centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk és a fehérjét kvantitatíven mérjük, a Bio-Rad Protein Assay készletet (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia) alkalmazva. 100 és 10000 ngfehérjét (ez mindegyik baktérium-extraktumnál változó) az egyes baktériumokból nátriumdodecü-szulfát (SDS)-poliakrilamid gélelektroforézisnek vetünk alá (Kusecek B. és munkatársai:,JLipopolysaccharide, Capsule and Fimbriae as Virulence Factors Among 01,07,016 or 075 and Kl, K5 or K100 Escherichia coli” /Lipopoliszacharidok, tokok és rojtok, mint virulencia-faktorok az E. coli 01,07,016,018 vagy 075 és Kl, K5 vagy KlOO törzsek között/. Infection and Immunity, 43, 368-379 /1984/). Az egyes molekula-fajtákat külön-külön átvisszük a gélről nitrocellulóz membránra (NCM), amint ezt másutt már leírták (Towbin H. és munkatársai: „Electrophoretic Transfer of Proteins From Polyacrylamide Gels to Nitrocellulosa Sheets: Procedure and Same Applications” /Fehérjék elektroforetikus átvitele poliakrüamid gélekről nitrocellulóz lapokra: eljárás és néhány alkalmazási lehetőség/, Proc. Natl. Acad. Sei. 76,4350-4354 /1979/), 10
