203583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriális fertőzések ellen védő emberi monoklonális antitest-készítmények és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203583B és az NCM foltot 1 órán át blokkoljuk PBS-Tweenben (Batteiger B. és munkatársai: „The Use of Tween 20 as a Blocking Agent in the Immunological Detection of Protein Transferred to Nitrocellulosa Membranes” /Tween 20, mint blokkolószer alkalmazása a nitrocellulóz membránokra átvitt fehérjék immunológiai kimutatásában/, J. Immunoi. Meth. 55,297-307 /1982/). A foltot egy órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk 10 ml, 7D7 sejtvonalból származó kifejlett tenyészet felülúszóban. PBSTween-ben végzett négy 5 perces öblítéstkövetően a foltot kecske-anti-humán Ig-vel konjugált alkálikus foszfatázzal inkubáljuk és kifejlesztjük, amint ezt fentebb a baktérium-nitrocellulóz lemez vizsgálatoknál leírtuk. Pozitív reakciókat figyelünk meg mindegyik nyomon, amely az itt leírt baktériumok dezoxikolátos extraktumait tartalmazza. Ezekben a nyomokban a 7D7 antitest úgy tűnik, egy sor szabályos térközű molekuláris egységet ismer fel, amely létraszerű elrendezést hoz létre az immunfolton. Ez a profü teljesen egybevág azzal, amelyet az LPS poliakrilamid gélelektroforetikus elemzésében látunk SDS jelenlétében, ahol ez azt demonstrálja, hogy a csíkok által mutatott heterogén méret-profü a súlynövekedés szerint különböző LPS molekulák populációjának tulajdonítható, ahol a súlynövekedés a molekulánként jelen levő O-antigén oligoszacharid oldallánc-egységek számával ekvivalens (Pavla E.T. és Makela PH. „Lipopolysaccharide Heterogeneity in Salmonella typhimurium Analyzed by Sodium Dodecyl Sulfate/Polyacrylamide Gel Electrophoresis” /Lipopoliszacharid heterogenitás Salmonella typhimuriumban, nátrium-dodecilszulfát/poliakrilamid gél elektroforézis alapján elemezve/, Eur. J. Biochem., 107, 137-143 /1980/; Goldman R.C. és Leive L.:, .Heterogeneity of Antigenic-Side-Chain Lenght in Lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and Salmonella typhimurium LT2” /Antigén oldallánchossz heterogenitás az Escherichia coli 0111 és Salmonella typhimurium LT2 törzsekből származó lipopoliszacharidokban/, Eur. J. Biochem., 107, 143-154 /1980/). Ezek az adatok azt jelzik, hogy a 7D7 monoklonális antitestek olyan antigén determináns ellen irányulnak, amely az E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae és E. aerogenes bizonyos szerotípusain található LPS molekulákban részt vesz. Hogy az antigén molekuláris természetét tovább definiáljuk, a dezoxikolátos extraktumokat elektroforézisük előtt a K proteináz proteolitikus enzimmel kezeljük (Eberling W. és munkatársai: „Proteinase K from Tritirachium album Limber” /K proteináz a Tritirachium album Limber-ből/ Eur. J. Biochem. 47,91-97 /1974/). Hogy a mintát előállítsuk, 10 jig proteinázt a minta fehérjével összekeverünk és a keveréket 65 °C hőmérsékleten tartjuk. A mintákat elektroforézisnek és immunfolt-képzésnek vetjük alá, amint ezt fentebb leírtuk. A K-proteinázos kezelés után megfigyelt immunfolt-összeállítások azonosak azokkal az összeállításokkal, amelyet kezelés nélkül figyelünk meg, így ez azt sugallja, hogy a 7D7 antitesttel reaktív antigén nem fehérje természetű. Hogy speciálisan megcélozzuk, vajon a 7D7 valamely szénhidrát epitóppal reagál-e, az elektro-19 transzferált dezoxikolát mintát szelíd perjodátos oxidációnak vetjük alá, mielőtt a nitrocellulózos papírt az antitesttel reagáltatnánk. Erről a reakcióról azt mutatták ki, hogy elroncsolja a szénhidrát determinánsokat, és így elroncsolja ennek ezt követő reaktivitását is antitesttel, ugyanakkor nem változtatja meg a fehérje vagy lipid epitópokat (Woodward Mi. és munkatársai: „Detection of Monoclonal Antibodies Specific for Carbohydrate Epitopes Using Periodate Oxidation” /Szénhidrát epitópokra fajlagos monoklonális antitestek kimutatása perjodátos oxidációt alkalmazva/, J. of Immunol. Methods, 78, 143-153 /1985/). Röviden, miután az elektroforézisnek alávetett mintát tartalmazó, elektromosan foltokkal ellátott nitrocellulóz papírt PBS-Tweennel blokkoltuk, amint ezt fentebb leírtuk, a papírt leöblítjük 50 mmól/l-es ecetsav-nátrium-acetát puffernd (pH 4,5). A nitrocellulóz papírt 50 mmól/1 perjódsawal (ecetsavas puffert» oldva) 60 percen át inkubáljuk sötétben szobahőmérsékleten. A kezelt papírt háromszor leöblítjük PBS-Tweennel és az antitesttel reagáltatjuk, amint ezt korábban leírtuk. Az üyen módon kezelt, elektromos foltképzésnek alávetett dezoxikolátos extraktumok már nem reaktívak a 7D7 monoklonális antitesttel. Ezek az adatok erőteljesen jelzik, hogy az ez által az antitest által felismert epitóp olyan szénhidrát, amely az itt leírt baktériumok LPS molekuláin van jelen. A 7D7 monoklonális antitest izotípusát ELISA eljárással határozzuk meg a f entebb leírt fa jlagossági vizsgálathoz hasonlóan, azzal a kivétellel, hogy biotinilezett kecske anti-humán IgG-t (gamma-lánc fajlagos, TAGO) vagy biotinüezett kecske anti-humán IgM-et (mű-lánc fajlagos, TAGO) alkalmazunk második lépéses reagensként a sokkal szélesebb reaktív biotinilezett kecske antihumán lg helyett. Mindkét reagenst 1:500 hígításban alkalmazzuk, és az antigén lemez PLL-lel immobilizált E. coli 08 és 075 törzsek gyűjteményét tartalmazza. A 7D7 monoklonális antitest pozitív reakcióját az E. coli törzsekkel csak az anti-IgM reagenssel figyeljük meg, ezzel szemléltetve a monoklonális antitesthez tartozó IgM izotípust. Azok, akik a szakterületen jártasak, méltányolni tudjuk, hogy ha a fenti folyamatot többször ismételjük és az így nyert nemzetségek közti kereszt-reaktív monoklonális antitestek izotípusát meghatározzuk, találni lehet további, pl. IgM és IgG izotípusokat (Frosch M. és munkatársai: NZB Mouse System For Production of Monoclonal Antibodies to Weak Bacterial Antigens: Isolation of an IgG antibody to the Polysaccharide Capsules of Escherichia coli Kl and Group Meningococci” /NBZ egér-rendszer bakteriális antigének legyengítésére szolgáló monoklonális antitestek előállításához: IgG antitest izolálása az Escherichia coli KI és a Meningococcus csoport poliszacharid kapszuláihoz/, Proc. Natl. Acad. Sei. 82,1194-1198 /1985/). G.In vitro aktivitás A 7D7 monoklonális antitest in vitro funkcionális aktivitását vizsgáljuk in vitro opszono-fagocitózis vizsgálatban, amely összehasonlítja az antitest bakteriocid aktivitását mind humán neutrofilok, mind humán komplement jelenlétében és távollétében. 20 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
