203583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriális fertőzések ellen védő emberi monoklonális antitest-készítmények és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

HU 203583B

felülúszót elemzünk a fenti módszerrel, és ez egy olyan üreg (4F10) azonosítását eredményezi, amely aktivitással rendelkezik S. marcescens szerotípus lemezen, de nem rendelkezik aktivitással E. coli vagy kontroll lemezen. Meghatározzuk egy ezt kö- 5 vető, egyedi S. marcescens szerotípusokkal végzett ELISA vizsgálattal, hogy ez az üreg 015 és 018 szerotípusú S. marcescenssel reaktív antitestet tartalmaz, de ez nem reaktív a húsz ismert S. marcescens LPS szerotípus bármelyik további tagjával. 10

Ajelen szabadalmi bejelentés benyújtása előtt 4F10-nek azonosított folyamatos transzformált sejtvonalat letétbe helyeztünk az American Type Culture Collection-nál (Rockville, Maryland), ATCC CRL 9007 letéti számon. 15

2. A klónozott 4F10 sejtvonalból származó anti27

testet megvizsgáljuk további nemzetségek közti keresztreaktivitásra a standard immun-foltképző technika módosításával. Részletesebben, a K. pneumoniae, E. aerogenes és E. cloacae baktériumokra való kereszt-reaktivitást vizsgáljuk olyan módon, hogy baktériumokkal foltokat képzünk egy hálózattal ellátott nitrocellulóz papír lemezen, a baktériumokat tartalmazó lemezt az említett antitesttel reagáltatjuk, és az antitest reakciókat alkálikus foszfatáz/nitrokék-tetrazólium enzim rendszerrel kifejlesztjük.

Ezekben a kísérletekben a 4F10 antitestről megfigyeljük, hogy további nemzetségek közötti kereszt-reaktivitással rendelkezik. Ez az antitest a következő szerotípusokkal reagál:

28

K. pneumoniae S. marcescens E. areogenes

K3,12,29,31,68,72 015,18 Klinikai izolátumok

így a 4F10 humán monoklonális antitest a S. marcescens, K. pneumoniae és E aerogenes fajokra tatozó baktériumokra nemzetségek közötti kereszt- 25

reaktivitással rendelkezik.

3. Az immun-folt technikát alkalmazva pozitív reakciókat figyelünk meg az összes olyan nyomon, amely az itt leírt baktériumok dezoxikolátos extraktumait tartalmazza. Ezekben a nyomokban a 4F10 30

antitest úgy tűnik, felismeri vagy komponensek széles csíkjait, vagy szabályos térközű molekuláris egységek sorozatát, létraszerű elrendezést hozva létre.

Ez a profil teljesen egybevág azzal, amely a szénhidrát részek poliakrilamid gélelektroforetikus elem- 35 zésében látható, ez vagy gyakran ismétlődő speciális cukorszekvenciáknak tulajdonítható erőteljes molekulasúly heterogenitást demonstrál, vagy a zO- antigén oligoszacharid oldallánc egység/molekula számával ekvivalens súlygyarapodás szerint külön- 40 böző LPS molekuláknak tulajdonítható (Vimr E. R. és munkatársai: „Use of Procaryotic-Derived Probes to Identicy Poli /Sialic Acid/ in Neonatal Neuronal Membranes” /Prokarióta eredetű vizsgáló minták alkalmazása poli (szialinsav) azonosítására új- 45 szülött neuron-membránokban/, Proc. Natl. Acad.

Sei. 81,1971-1975/1983/; Holden K.B. és munkatársai: „Gel Electrophoresis of Mucous Glycoproteins I. Effect of Gel Porosity" /Nyál glikoproteinek gélelektroforéziseLAgél porozitásúnak hatása/, Bi- 50

ochemistra, 10,3105-3109/1971/). Ezek az adatok azt jelzik, hogy a 4F10 olyan antigén determináns ellen irányul, amely egyaránt részt vesz a S. marcescens, K. pneumoniae és E. aerogenes bizonyos szerotípusain található szénhidrát molekulákban. 55

A K proteinázos kezelés után megfigyelt immun - folt-elrendezés azonos azokkal az elrendezésekkel, amelyeket a kezelés nélkül figyelünk meg, ez pedig azt sugallja, hogy az 4F10 antitesttel reagáló antigén nem fehérje természetű. 60

Hogy speciálisan megcélozzuk, vajon a 4F10 reagál-e szénhidrát epitóppal, az elektromos úton átvitt

dezoxikolátos mintát szelíd perjodátos oxidációnak vetjük alá, mielőtt a nitrocellulóz papírt reagáltatnánk az antitesttel. Az ilyen módon kezelt, elektromos úton foltokat alkotó dezoxikolát extraktumok tovább már nem reaktívak a 4F10 monoklonális antitesttel. Ezek az adatok erőteljesen jelzik, hogy az ez által az antitest által felismert epitóp szénhidrát rész, amely az itt leírt baktériumok molekuláin van jelen.

4. A 4F10 monoklonális antitest izotípusát ELISA eljárással határozzuk meg a fajlagossági vizsgálatokhoz hasonlóan, az I. példában leírtak szerint, azzal a különbséggel, hogy az antigén lemez PLL-lel immobilizált S. marcescens 015 és 018 szerotípusok gyűjteményét tartalmazza. A 4F10 monoklonális antitest pozitív reakcióját csak az anti-IgM reagenssel figyeljük meg S. marcescens szerotípusoknál, ez azt demonstrálja, hogy a monoklonális antitest IgM izotípusú. Azok, akik a szakterületen jártasak, méltányolni tudják, hogy ha ennek a példának az eljárását többször ismételjük és az így kapott nemzetségek között kereszt-reaktív monoklonális antitesteket meghatározzuk, további izotípusokat is találhatunk, pl. IgM és IgG izotípusokat.

5. A 4F10 monoklonális antitest in vitro funkcionális aktivitását opszonofagocitás vizsgálatban vizsgáljuk, amely összehasonlítja az antitest bakteriocid aktivitását mind humán neutrofilek, mind humán komplement jelenlétében és távollétébcn.

Az itt használt bakteriális szerotípusok csak 4F10 monoklonális antitest, egy aktív komplementforrás, és humán neutrofilek jelenlétében inaktiválódnak (3. Táblázat). Amikor ezt a kísérletet megismételjük több nem-4F10 reaktív bakteriálsi szerotípussal, a baktériumok elroncsolódása nem következik be (adatokat nem mutatunk be), így ez a 4F10 monoklonális antitest funkcionális fajlagosságát demonstrálja, valamint azt a képességét, hogy opszonizálja a baktériumokat és elősegíti fagocitózisukat.

15